[发明专利]一种快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法

摘要

本发明提出了一种快速高效的植物人工微RNA(amiRNAs)表达载体构建方法，它是通过以下两大步骤完成的。一)含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建：1)选择并改造供体骨架载体，2)引物设计，3)PCR扩增，4)同源重组转化筛选；二)将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上：1)选择并改造受体载体，2)采用接合辅助的遗传整合克隆方法将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，验证重组子，选出植物amiRNAs表达载体。在改造供体骨架载体和受体载体时，分别克隆了筛选标记基因或报告基因表达单元和大肠杆菌条件致死基因表达单元。本发明不需要酶切连接反应，也不需要对载体或目的片段进行特殊处理，整个过程操作简单方便，实验周期短，重组效率高，能够快速、高效、零背景、高通量地构建植物amiRNAs表达载体。

主权项

1.一种快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法，其特征在于步骤为：一)含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建1)选择并改造供体骨架载体，在miRNA5’与3’侧翼序列之间克隆一筛选标记基因或报告基因表达单元，在5’侧翼序列的前面添加一个控制植物amiRNAs表达的启动子，在3’侧翼序列的后面添加一终止子序列，得到植物amiRNAs的供体骨架载体；2)引物设计，根据在线软件或相关运算规则，设计针对目的基因进行RNA干扰的靶序列，首先以miRNA的环序列为基础，设计一条长度与其相同的引物①；然后根据前面所述的amiRNAs的供体骨架载体上miRNA的5’侧翼序列和3’侧翼序列，设计一对PCR引物②和③，该对引物应该在与amiRNAs供体骨架载体特异性退火的序列5’末端加上已设计的靶序列TS1、TS2，除此之外，引物②还应在5’末端加上与引物①特异性退火的序列LSP1，引物③的5’末端还应加上引物①5’末端的10-15nt序列HR，使两者末端产生10-15bp的同源序列；3)PCR扩增，利用2)中设计的引物①②③，以前面所述的amiRNAs供体骨架载体为模板，经套式PCR扩增，获得的PCR产物含有amiRNAs供体骨架载体上的miRNA的侧翼序列和干扰目的基因的靶序列，而且PCR产物5’和3’末端分别带有部分miRNA的环序列，同时PCR产物缺失了amiRNAs骨架载体中的筛选标记基因或报告基因表达单元；4)同源重组转化筛选，获得的PCR产物直接转化大肠杆菌DH10β感受态细胞，在大肠杆菌体内经同源重组自环化，得到含有干扰目的基因的靶序列的amiRNAs表达单元的供体质粒；二)将人工微RNAs表达单元克隆到植物双元载体上1)选择并改造受体载体，首先在植物双元载体上克隆一大肠杆菌条件致死基因表达单元，而且该表达单元两端分别带有一个I-SceI酶切位点以及一段与含有amiRNAs表达单元的供体质粒同源的50bp序列，将其转入大肠杆菌BUN21(pML300)中；2)采用接合辅助的遗传整合克隆方法将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体上，验证重组子，选出植物人工微RNA表达载体。