[发明专利]一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法

摘要

本发明公开了一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法，该重组质粒pASK－αβγA构建如下：以含αβγA基因的质粒为模板，以带ASK同源臂为引物，通过PCR扩增获得带同源臂的PCR产物αβγA，以pASK－IBA为载体，采用Red/ET重组构建质粒pASK－αβγA，对质粒鉴定。该red/ET重组如下：首先合成带需修饰基因同源臂的引物；其次PCR扩增获得带需修饰基因同源臂打靶基因；第三将red/ET重组质粒pASK－αβγA导入photorhabdus luminescens中；第四将含有pASK－αβγA的photorhabdus luminescens过夜菌接种于LB中，培养；第五加脱水四环素诱导；第六将带需修饰基因同源臂的打靶基因PCR产物转化入pASK－αβγA中；最后是将其铺在选择性LB平板上，培养，去除质粒pASK－αβγA。该方法同源序列短，重组效率高，快捷方便。

主权项

1.一种用于发光光状杆菌的red/ET重组方法，它包括下列步骤：A、用于发光光状杆菌的red/ET重组质粒pASK-αβγA构建：a、带ASK同源臂的PCR产物αβγA的获得，以pSC101-BAD-αβγA质粒DNA为模板，以p1、p2为引物，进行PCR扩增获得带ASK同源臂的PCR产物αβγA；p1：5’GAIAG AGAAA AGTGA AATGA AIAGT TCGAC AAAAATCTAG CAGGA GGAAT TCACC ATG GAT ATT AAT ACT GAAACT GAG’3；P2：AATGT GCGCC ATTTT TCACT TCACA GGTCA AGCTTCTCGA GATCC TAGC TTA AAA ATC TTC GTT AGT TTCTGC；b、重组质粒pASK-αβγA的构建，将30μl过夜菌E.coli YZ2005接种于1.4mlLB，振摇2h，采用电转的方法将带ASK同源臂的PCR产物αβγA和被Nco I酶切pASK-IBA共转化入E.coli YZ2005中，恢复培养1h；将其铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养，从过夜培养的含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板挑单克隆，将重组克隆接种于1.8ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中，振摇过夜，制备质粒DNA，溶于20μlddH2O，取4μl质粒DNA进行限制性酶切鉴定；挑出克隆制备质粒DNA进行测序；B、利用red/ET重组方法在photorhabdus luminescens DSM15138中将cmr 基因替换染色体DNA上的cipB基因：a、带cipB同源臂cmr基因的引物的合成P3：5’TATTCTACAG AATATTTTTT CAAACACTCA TTTAGAAATTTAACAAATAA TTC TTA CGC CCC GCC CTG CCA CTC ATC3’；p4：5’AAGTTATTTA TCAATTGGTT AGATTAAAAT TTGGAGTTTATGTTGC GTA TCA CGA GGC CCT TTC GTC3’；b、带cipB同源臂cmr基因PCR产物的获得，以质粒pSC101-705-flp-cmrDNA为模板，以p3和p4为引物，进行PCR扩增获得带cipB同源臂的cmr基因；c、将red/ET重组质粒pASK-αβγA导入photorhabdus luminescens DSM15138中，首先将30μl新鲜过夜培养photorhabdus luminescens DSM15138接种于1.4mlLB中，30℃，1050rpm下振摇培养3h；第二是感受态细胞的制备：将1.4ml菌液冰浴5min；4℃，11,000rpm下离心0.5min，弃上清；加入0.9ml预冷的10％甘油+2mM HEPES重悬菌体；4℃，11,400rpm下离心0.5min，弃上清；加入0.9ml预冷的10％甘油+2mM HEPES重悬菌体；4℃，12,000rpm下离心0.5min，弃上清，留50μl于Ep管中；加入1μl质粒pASK-αβγA，混匀，转入预冷的电转杯中；第三是采用电转的方法将pASK-αβγA转化入photorhabdusluminescens DSM15138中，30℃恢复培养1h；第四是将其铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，30℃培养过夜；第五是限制性酶切和Western blotting对克隆子进行鉴定；d、将40μl过夜菌含有pASK-αβγA的photorhabdus luminescens DSM15138接种于1.4ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中，30℃振摇培养2h，加2μl2mg/ml AHT(anhydrotetracycline脱水四环素)，30℃诱导60min；e、采用电转的方法将带cipB同源臂的cmrPCR产物转化入含有pASK-αβγA的photorhabdus luminescens DSM15138中，30℃恢复培养1h，将其铺在含有15μg/ml氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养；f、42℃下热激去除质粒pASK-αβγA，对所得克隆进行鉴定。