[发明专利]肉孢子虫孢子囊和卵囊分子的诊断方法

摘要

肉孢子虫孢子囊和卵囊分子的诊断方法，属于寄生虫病的诊断，涉及基因诊断畜禽和人体的球虫与球虫病。本发明目的是改变以包囊检测肉孢子虫的一般方法，提供基因诊断方法。包括取少量粪便加入37％ZnSO₄硫酸锌漂浮液离心静置；沾取上层浮液数滴于载玻片以显微镜检查，用清洁纸片采集样本保存；编码具有肉孢子虫孢子囊和卵囊的18SrRNA基因区段1500－2000bp核苷酸或其任何一部份核苷酸片段作为引物用于PCR扩增，或作为探针用于杂交反应，或制备基因芯片或微阵列；对各虫种的特异性的扩增片段，用特定引物检测核苷酸序列，或用特定限制性内切酶和反应条件酶切反应，酶切反应的体积为10－20ul，结果用凝胶检测。本发明从孢子囊和卵囊阶段鉴别虫种，灵敏度和特异性高、临床检测方便，具有重要的公共卫生学意义和经济价值。

主权项

1.肉孢子虫孢子囊和卵囊分子诊断方法，包括以下步骤和内容：1)取1-2g的粪便加入适量37％ZnSO4硫酸锌漂浮液离心管中，离心后静置；2)用吸管吸取或用接种环沾取离心管中最上层的浮液数滴移在载玻片上，以大于100倍的显微镜检查，用清洁纸片从玻片或者离心管中粘起孢子囊和卵囊放入另一只离心管低温保存；3)包含其有表1为引物，PCR扩增所覆盖的肉孢子虫孢子囊和卵囊的18SrRNA基因区段1500-2000bp核苷酸或其任何一部份核苷酸片段，或作为引物用于PCR扩增，或作为探针用于杂交反应，或制备基因芯片或微阵列；表1用于肉孢子虫18SrRNA基因的PCR和测序引物 引物 方向 系列 5’——3’ 位置 18S 2L 18S 2H Forward Reverse GGATAACCTGGTAATTCTATG ACCTGTTATTGCCTCAAACTTC 156-178* 1530-1551**根据Holmdahl(1994)的梭状肉孢子虫系列位置定位4)对各虫种的特异性的扩增片段，或做酶切分析，或用表1的引物作为测序引物检测核苷酸序列，进行酶切分析时，用选自表2中限制性内切酶和反应条件进行酶切反应，酶切反应的体积为10-20ul，结果用凝胶检测，表2.用于肉孢子虫18SrRNA基因酶切分析的酶及其酶切条件 酶名称 酶切工作条件 缓冲液 时间 (h) 酶用量 (U) 温度 (℃) EcoR I Pst I Alu I Mbo I Mbo II Taq I Hinf I Bcl I Rsa I Ssp I Acc I Dra I Xba I H H B C B E B C C E G B D 8 20 8 10 50 8 8 48 10 16 8 10 8 10 5 5 5 5 5 5 5 10 7 5 10 10 37 37 37 37 37 65 37 50 37 37 37 37 37