[发明专利]检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法

摘要

本发明公开了一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法。本发明方法同时检测四种病毒都呈良好的线性关系，构建的标准质粒10倍系列稀释的各个点均在一条直线上，CT值与拷贝数之间均呈良好线性关系，回归分析显示，二者相关系数为R²＞0.99。本发明方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，能快速、敏感、特异地检测对经济危害严重的4种病毒，可应用病毒感染的前期诊断。

主权项

1. 一种同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒的多重实时荧光定量PCR方法，包括制备4种病毒的标准质粒并建立标准曲线，确定判定样品阳性或阴性的标准，设计检测引物进行样品的荧光定量PCR扩增并获得样品的Tm值，将所获得的Tm值用所确定的判定标准评判样品的阳性或阴性等步骤，其特征在于，所述的标准曲线的建立方法如下：(1)按照常规方法分别提取猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒的核酸；(2)以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，以所提取的II型猪圆环病毒(PCV2)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得II型猪圆环病毒标准质粒；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，以所提取的猪细小病毒(PPV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪细小病毒标准质粒；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为引物，以所提取的猪伪狂犬病毒(PRV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪伪狂犬病毒标准质粒；以SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8为引物，以所提取的猪瘟病毒(HCV)核酸为模板，按照常规方法进行PCR扩增，将扩增的产物回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，转化，提取质粒DNA，得猪瘟病毒标准质粒；(3)将步骤(2)所制备的4种标准质粒分别作10倍系列稀释，以稀释液为模板，进行实时荧光定量PCR，采集荧光信号，经计算机软件Rotor-gene6.0生成以起始模板数对数为x轴，CT值为y轴的标准曲线；所述的确定判定阳性或阴性的标准是：在CT值在35循环内；Tm值分别为：PCV-2：86.69±0.21；PPV：79.97±0.15；PRV：88.56±0.15；HCV：84.61±0.16；所述的检测引物为：检测II型猪圆环病毒(PCV2)的引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；检测猪细小病毒(PPV)的引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；检测猪伪狂犬病毒(PRV)的引物为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；检测猪瘟病毒(HCV)的引物为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。