[发明专利]一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜遗传转化方法的建立及转基因苗的培育

摘要

一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的农杆菌介导的转基因方法及其转基因苗的培养方法：天蓝遏蓝菜成熟种子经消毒处理后置于种子萌发培养基上发芽后转移至分化培养基培养至丛生芽生成并接种于预培养基中培养；农杆菌侵染后置于共培养基上进行共培养，转接到前培养基上至丛生芽增生；转接到筛选培养基上分化出抗性丛生芽；将丛生芽置于基本培养基中进行壮苗培养；转移至生根培养基进行初步生根培养后转移至荷格兰特营养液中水培继续生根培养，之后再将生根的壮苗移栽到苗圃基质中进行移栽定植培养，得到转基因天蓝遏蓝菜成熟植株。本方法可排除外界条件影响，四季可行，节约育苗占地，降低生产成本，而且短期内得到大量健壮转基因幼苗，满足分子生物学研究和生产应用。

主权项

1、一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜遗传转化方法的建立及转基因苗的培育，其步骤如下：1)建立初代培养物-天蓝遏蓝菜幼苗取天蓝遏蓝菜成熟种子，用酒精进行表面消毒，之后，置于氯化汞中浸泡后取出；再进行无菌水冲洗，灭菌，并用滤纸吸干其表面水分；再置于种子萌发培养基上培养7-15天，得初代培养物-天蓝遏蓝菜幼苗；其培养条件为：光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述种子萌发培养基为MS培养基；2)天蓝遏蓝菜丛生芽的培养将上述天蓝遏蓝菜幼苗置于分化培养基上进行丛生芽的分化培养10-14天，至茎节处分化出丛状小苗即丛生芽；其培养条件为：光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述分化培养基所含组分及配比为：每升分化培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，以及6-苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述分化基本培养基为MS培养基；3)天蓝遏蓝菜丛生芽的预培养将以上所述天蓝遏蓝菜丛生芽平铺在预培养培养基上进行预培养2-3天；其预培养条件为：光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述预培养培养基所含组分及配比为：每升预培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；所述预培养基本培养基为MS培养基；4)农杆菌的活化分别挑取带有目的基因Bjcat5的双子叶植物表达载体的农杆菌的单菌落，接种到5毫升LB农杆菌液体培养基中培养8小时；其培养条件为28℃，200转/分；取培养过夜的LB农杆菌培养液，按1∶40的比例稀释至20毫升LB液体农杆菌培养基中，继续培养5-6小时，至OD600为0.6；经5000转/分，离心5min；收集菌体，用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD600为0.15侵染液体培养基；备用；所述LB农杆菌液体培养基所含组分及配比为：每升LB农杆菌液体培养基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，10克的氯化钠，50毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH＝7.0；所述侵染液体培养基为MS培养基，pH＝5.2；5)经预培养的天蓝遏蓝菜丛生芽的农杆菌侵染和共培养将预培养2-3天的天蓝遏蓝菜丛生芽置于上述含有农杆菌的OD600 为0.15的侵染液体培养基中，浸泡5-15分钟后取出；用滤纸吸干附着其表面的菌液，平铺在共培养培养基上，25℃下，暗培养2天；所述共培养培养基所含组分及配比为：每升共培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；所述共培养基本培养基为MS培养基；6)前培养将步骤5)培养后的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，分别置于三角瓶中；用无菌水冲洗3-5次后，再用含羧苄青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次，每次10分钟；用含羧苄青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗1-2次；将丛生芽取出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹干；平铺于前培养基上培养3-15天；其培养条件：光照强度3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述前培养培养基所含组分及配比为：每升前培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述前培养基本培养基为MS培养基；7)筛选培养将经前培养3-15天的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，转移至筛选培养基上；培养条件：光照强度3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；18天继代一次，得试管丛生芽苗；所述筛选培养基所含组分及配比为：每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克，卡那霉素5-50毫克和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述筛选基本培养基为MS培养基；8)壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到壮苗培养基中培养18-35天，得试管苗；所述壮苗培养基所含组分及配比为：每升壮苗基本培养基中含蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，肌醇50-300毫克，羧苄青霉素250毫克和卡那霉素5-50毫克，pH＝5.8；所述壮苗基本培养基为MS培养基；9)生根培养将经过壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，接种到生根培养基中培养18-25天，得生根苗；从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培继续生根培养；其培养条件为：以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22-25℃，光照16小时/天，湿度80-85％；所述生根培养基所含组分及配比为：每升生根基本培养基中含蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，肌醇50-300毫克，羧苄青霉素250毫克和卡那霉素5-50毫克，pH＝5.8；所述生根基本培养基为1/2MS培养基；10)移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1∶1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95％，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80％，温度20-30℃，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成天蓝遏蓝菜转基因苗的培养。