[发明专利]一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法

摘要

本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，属于生物技术领域。包括单细胞悬浮液的制备，采用美国BeckMAN COULTER公司生产的Epics XL型号的流式细胞仪，流式细胞仪倍性分析，发光源为488nm氩离子空冷激光；测定DNA分子荧光强度，待测植株峰值处在140附近的视为二倍体，而处在70和280附近的分别视为单倍体和四倍体。流式细胞仪倍性检测结果与在成株期进行花期形态鉴别相一致。应用此法，可在幼苗期快速鉴定出不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性，大大提高DH群体构建和遗传图谱绘制的效率，从而加速了育种进程。

主权项

1.一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，包括：(1)单细胞悬浮液的制备：称取100mg试管苗嫩茎或幼叶在滴有2mL提取缓冲液：15mmol·L-1 Tris-HCl、pH 7.5，80mmol·L-1 KCl，20mmol·L-1 NaCl，20mmol·L-1 EDTA-Na2，15mmol·L-1巯基乙醇和体积比0.05％的Triton X-100的培养皿中切碎，300目尼龙网过滤，1000r/min离心并漂洗细胞3次，收集沉积细胞，加入2mL染色缓冲液，缓冲液中加3000U·mL-1 RNA酶A，10μg·mL-1碘化丙锭，暗处低温染色30min；500目尼龙网过滤，机用标准管收集，单细胞悬浮液随即上机测定；(2)流式细胞仪倍性分析：采用美国BeckMAN COULTER公司生产的Epics XL型号的流式细胞仪，其激发光源为488nm氩离子空冷激光；经激发，染色的DNA分子促发荧光，检测器测定荧光强度，通过光电倍增管将光信号转变为电信号，经过放大，A/D转换，输入计算机进行分析并得到图像信号；与测定装置相连的计算机分析软件为：EXPO32ADC software，即可对荧光强度进行分析；所用鞘液购买于贝克曼库尔特实验系统有限公司；测量时间设定为300s；测量前，调校流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，进行FLOWCHECK校正，使各通道的变异系数CV稳定在3％以下，荧光强度由仪器自动检出；通过手动选择流速快慢保持细胞分离纯度；以普通二倍体不结球白菜2n＝20为对照，二倍体对照分离峰的荧光强度处在140附近，待测植株峰值处在140附近的视为二倍体，而处在70和280附近的分别视为单倍体和四倍体。