[发明专利]体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的方法

摘要

一种体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的方法，其特征在于方法步聚如下：1.骨髓基质干细胞的提取、分离和培养；2.珊瑚复合人工骨的制备；3.灌注系统的建立。本发明的优点是：1.不仅解决大块组织工程骨快速血管代的难题，还可实现生长因子在损伤局部持续或间断持续微量稳定的缓释；2.具有安全高效、操作简单、成本低廉的优点。

主权项

1、体内灌注诱导骨髓基质干细胞构建组织工程骨的方法，其特征在于方法步聚如下：(一)骨髓基质干细胞的提取、分离和培养(1)骨髓基质干细胞的提取：无菌条件下，于髂后上棘处骨穿针穿刺，预肝素化处理的注射器抽出骨髓；(2)骨髓基质干细胞的分离和扩增培养：将含有1％肝素抗凝剂的骨髓置于离心管中，加入约为骨髓体积1∶1～2∶1的无血清培养基，在1000r/min离心10min，弃去上清液，清洗2～3次，去除上层脂肪和组织液，将下面细胞层用完全培养基再悬，吸入培养皿中，加入完全培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱进行培养，培养2-3w，汇合成单层后用质量浓度为0.25％胰蛋白酶和质量浓度为0.02％的EDTA混合液消化，终止消化后进行细胞传代，继续培养扩增至第三代细胞；(二)珊瑚复合人工骨的制备根据管状骨缺损的大小和形状，将天然滨珊瑚加工成内径2mm未贯通的圆桶状，超声清洗，高压蒸汽消毒后备用，用含自体血清的完全培养基将第三代BMSC制成10×106 /ml细胞悬液，注射器吸取BMSC悬液滴入NC，确保NC完全浸润且不渗漏，使成BMSC-NC复合物，置于37℃体积分数为5％的CO2孵育箱中5小时后，加入含自体血清的完全培养基培养，BMSC-NC复合物体外培养5天，待BMSC与NC贴附牢固后再回植入骨缺损处；(三)灌注系统的建立将圆桶状的BMSC-NC复合物直接嵌入骨缺损处采用适当方式固定，在此基础上安装双泵组成的灌注系统，术后闭合创口，整个系统分别由体内和体外使用的双泵系统联合组成，体内使用的泵系统为皮下植入式给药装置；体外使用的泵系统为便携式微量注射泵，皮下植入式给药装置由注射座和硅橡胶导管二部分组成，管的一头插入呈圆桶状的未贯通的复合有BNSC的NC中央，插入到NC内的导管的插入部分有多个侧孔，管道的另一头为埋植在左侧臀部皮下的注射座，针头与体外的便携式微量注射泵相连通，实现持续、缓慢低剂量地输入含自体血清的培养液以及rhBMP-2、rhbFGF细胞因子。