[发明专利]一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法

摘要

一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法，涉及一种生物粘合剂。提供一种通过生物基因工程方法制备具有可降解性和防水性，且生物相容性好的海洋贻贝-厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的方法。从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA，根据厚壳贻贝的Mcfp-1基因序列设计PCR引物，经PCR扩增，将获得的DNA片段连接到原核表达载体pGEX-4T中构建重组质粒，再转化到大肠杆菌BL21菌株中，最后将表达的多肽产物纯化、修饰。制备方法简单，表达产物为可溶性，易于纯化，成本低，与CELL-TAK^TM细胞和组织粘附剂相比有类似或者更好的效果，未发现细胞毒性。符合科研需要，可作为生物医用材料。

主权项

1. 一种海洋贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂的制备方法，其特征在于其具体步骤如下：1)从活的厚壳贻贝足部提取总RNA，反转录成cDNA；2)根据厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因(序列来自Genbank No.D63777)序列中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基(序列来自Genbank No.Q25434)的12个连续的十肽重复序列的DNA片段设计PCR引物，在前向引物和反向引物末端分别设有EcoR I和SalI酶切位点，引物序列如下：引物F：5’-ccgaattctataaacctaagaaaacttatcc-3’，引物R：5’-atgtcgacttacgttggtggatagcgtatc-3’；3)以步骤1)提取的cDNA为模板，用引物F和引物R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝M.coruscus的Mcfp-1基因中编码Mcfp-1氨基酸序列从第692位到第811位氨基酸残基的12个连续的十肽重复序列的DNA片段产物；其DNA片段(360bp)序列如下：Tataaacctaagaaaacttatcctccaacatataaaccgaagataagttatccaccaacgtataaaacaaagccaagttatccagcatcttataaacgtaagacaagttatcctccaacatataaacctaagataagttatccttcaacttataaagcaaagccaagttatccaccaacgtataagccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacgtataaaccaaaaccaagttatgcgtcatcatataaacctaagatacgctatccaccaacg编码的氨基酸(120aa)序列为：YKPKKTYPPTYKPKISYPPTYKTKPSYPASYKRKTSYPPTYKPKISYPSTYKAKPSYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPTYKPKPSYASSYKPKIRYPPT4)将PCR获得的DNA片段经克隆载体pMD18-T克隆，再切出连接到原核表达载体pGEX-4T中构建重组质粒；5)将构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导，表达出融合有GST的Mcfp-1第692位到811位氨基酸残基的多肽产物，标记为GST-Mcfp-1-12；6)用谷胱甘肽—琼脂糖树脂纯化该多肽产物；7)用凝血酶切除融合的GST，离心得到不溶性Mcfp-1功能肽段产物沉淀；8)最后用酪氨酸酶对纯化的多肽产物进行修饰，即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂，命名为Mcfp-1-12。