[发明专利]NF－κB位点缺失的DC－SIGN启动子真核质粒的构建方法

摘要

本发明公开了NF－κB位点缺失型DC－SIGN启动子真核质粒的构建方法。通过设计用EcorI酶切位点替代NF－κB位点的DC－SIGN启动子NF－κB位点上下两端引物，将DC－SIGN启动子报告质粒重的启动子序列分两端扩增，再通过酶切、连接及PCR扩增等方法重新得到NF－κB位点缺失的DC－SIGN启动子片段，将该片断插入pGL3－Basic质粒，成功构建了NF－κB位点缺失型DC－SIGN启动子真核质粒。通过与pGL3－Basic空质粒，DC－SIGN启动子质粒DSPGB和阳性对照质粒pGL3－Control在各种PMA、IL－4刺激情况下的活性进行比较，证实了所构建真核质粒NF－κB位点的缺失。

主权项

1.NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征在于下述步骤：(1)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点：ACGCGT和AGATCT，用PCR法高保真扩增DC-SIGN启动子片段，并纯化PCR产物，备用；(2)对DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，得到报告质粒DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic(DSPGB)，并作双酶切鉴定；(3)在NF-κB结合位点处分别设计5’→3’和3’→5’方向的两条引物PrimerA、PrimerB，两条引物与DC-SIGN启动子NF-κB位点上下两端序列匹配，并且用Ecor I酶切位点替代NF-κB位点；(4)根据已经构建好的报告质粒DSPGB的序列，在插入的启动子片段上下游分别设计两条引物PrimerC、PrimerD；(5)分别以PrimerA与PrimerC、PrimerB与PrimerD配对，对DC-SIGN报告质粒DSPGB进行PCR扩增，并用Ecor I对两个扩增片断进行酶切，酶切产物纯化后连接；(6)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点：ACGCGT和AGATCT，对上述连接产物用PCR法高保真扩增，重新得到NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子片段；(7)使用Mlu I和Bgl II对上述DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，作双酶切鉴定。