[发明专利]卡介苗多糖核酸—DDA佐剂的制备及应用

摘要

本发明为卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备及其应用，涉及生物工程，尤其是结核亚单位疫苗的免疫佐剂，目前唯一使用的结核病疫苗是BCG，但是BCG在不同地区、不同人群中的保护效率差异很大，以细胞免疫为主的结核亚单位疫苗要解决的主要问题是寻找有效的佐剂以及传递方式。本发明将卡介苗多糖核酸和二甲基三十六烷基铵即DDA联合制备新型佐剂，经过卡介苗菌种传代与培养、菌体收集、热酚法提取卡介苗多糖核酸，并将其与DDA联合应用作为融合蛋白AMM的佐剂构建结核亚单位疫苗，经小鼠免疫实验结果表明，本发明能有效运输和递呈抗原，诱导Thl型细胞免疫为主的免疫反应，具有增强蛋白疫苗免疫效应的有益效果。

主权项

1、卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备及其应用，其特征为卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备方法为：(1)菌种传代与培养将保存于2-8℃的卡介苗冻干菌种取出复溶，在苏通培养基上共培育3-12代；(2)菌体收集收集培养基表面的菌膜，注入离心管。在3-5℃离心，弃上清，将沉淀的菌体用蒸馏水配成混悬液，用比浊法确定菌液浓度，细菌在冰浴中破碎2-4h；(3)提取菌液与1. 5-3倍体积45％苯酚醋酸钠混匀，在65—70℃水浴中保持30—50min，然后移入3-5℃的冰浴，将菌液无菌转移至离心管，在3-5℃下离心，弃沉淀，收集上清，重复以上操作直至水相与酚相交界面无蛋白沉淀；预处理透析袋，将上清液装于透析袋中，在大体积的烧杯中流水透析10-15小时，随后用蒸馏水透析72小时，将透析袋中的液体全部转移至烧杯中，加入两倍体积的冰冷无水乙醇，以1∶10体积比例加入生理盐水，转至离心管中离心，分别以乙醇、乙醚混匀洗涤三次，在3-5℃下离心，收集沉淀并称重，按1mg/ml重悬于蒸馏水，分装入安瓿中，放冷冻干燥器中干燥成粉末状的卡介苗多糖核酸冻干制品。(4)配苗分别将卡介苗多糖核酸冻干制品用生理盐水溶解至0.6mg/ml，融合蛋白AMM用PBS稀释至1mg/ml；DDA用注射用水配制成2.5mg/ml，在70-85℃水浴中加热10min，取卡介苗多糖核酸溶液40-60μl与等量AMM蛋白充分混匀室温放置1min，加入80-120μl DDA然后充分乳化，最后疫苗呈均一的乳油状。