[发明专利]一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法

摘要

本发明涉及“一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法”，其特征在于待测HBV P基因YMDD motif及变异YIDD，YVDD序列通过杂交-连接酶反应置换成指示DNA，再反向扩增指示系统。所述YMDD杂交序列分成左右两半分别加在一段指示DNA首尾两端，加了首尾指示DNA与P基因YMDD区序列杂交，使其首尾靠近契合，杂交链缺口连接酶连接。所述反向扩增指示DNA，采用指示DNA正中间序列作为引物，反向扩增首尾共价相连指示DNA。其缺口两侧碱基匹配依赖性连接使其适合单碱基变异基因分析。一个检测可置换成许多指示PCR，避免仅一套系统扩增产物的再污染。待测RNA也可以杂交一连接反应置换成指示DNA而直接检测。或与SYBR Green染料或荧光分子探针联用还适用于待测基因的实时定量分析。

主权项

一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD motif及变异的置换扩增法，将待测P基因RT区DNA/RNA作为保留杂交序列与包括一套以上的指示加首尾DNA的首尾互补序列杂交，连接酶反应，指示加首尾DNA的首尾共价连接，形成置换指示DNA环，再反向PCR扩增所述置换指示DNA环；所述待测P基因RT区包括YMDD、及变异YIDD和YVDD基因的DNA样本，所述保留杂交序列为待测基因中P基因RT区含变异序列长度为20‑100bp序列；从变异基因开始断开形成左、右半部分序列，链长10‑50base；所述指示DNA的序列是与HBV基因包括P基因RT区序列无关的基因序列，序列长度为80‑1000bp；所述首尾互补杂交序列是指保留杂交序列的右半部分序列加在指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA，所述连接酶反应包括0℃‑20℃连接反应和热循环连接反应；所述反向PCR扩增是采用指示DNA正中间序列的右半部分作为反向引物Rev F，左半部分以互补反义序列作为反向引物Rev R，反向扩增置换指示DNA环，其特征在于：所述检测YMDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽‑S‑转移酶GST基因而得：YMDD 3’端引物MR：5’‑tg gat gat gtg gtW ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g‑3’，YMDD 3’端引物MR：5’‑t ata act gaa agc caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc‑3’；所述检测变异YIDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽‑S‑转移酶GST基因而得：YIDD 5’端引物IF：5’‑t gat gat gtg gtW ttg gaa gag cat ttg tat gag c‑3’，YIDD 3’端引物IR：5’‑at ata act gaa agc caR aca gtc tgc acg ctc ttt tgg‑3’；所述检测变异YIDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽‑S‑转移酶GST基因而得，YVDD 5’端引物VF：5’‑g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg‑3’，YVDD 3’端引物VR：5’‑ac ata act gaa agc caR aca gcc acc caa cat gtt gtg‑3’；所述反向扩增引物Rev F和Rev R如下：Rev F：5’‑at ggt gat gtt aaa tta aca c‑3’；RevR：5’‑atc aat ata ata agg aag att g‑3’。