[发明专利]橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法，其特征是以橡胶树花药或内珠被为外植体进行组织培养，并诱导培养产生橡胶树胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织进行继代增殖培养，并以增殖后的胚性愈伤组织为受体材料进行遗传转化；将转化后得到的抗性胚性愈伤组织进行继代和增殖培养；将继代增殖后的抗性胚性愈伤组织，经胚状体诱导过程诱导培养产生胚，并进一步成苗。本发明工艺流程简单，转化效率极高，成本低，克服了现有橡胶树遗传转化体系成胚率极低等严重缺陷，弥补了橡胶树转化受体材料的获得易受季节等自然条件限制的缺点，大大缩短了转化周期，是一种高效的橡胶树遗传转化方法，具有很大的科研及应用价值。

主权项

1.一种橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法，其特征在于：包括胚性愈伤组织的诱导培养过程、转化受体材料的继代增殖培养过程、遗传转化过程、抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程、继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程；1)所述胚性愈伤组织的诱导培养过程是指在橡胶树花药组织培养或内珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被经30～60天诱导的脱分化愈伤组织接入胚性愈伤组织诱导培养基，进行暗培养，约3个月从部分褐化的脱分化愈伤组织上会初生鲜黄、松散、透明的胚性愈伤组织，这些胚性愈伤组织进一步诱导能大量形成成熟胚；所述胚性愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加水解酪氨酸(50～400)mg/L、麦芽糖3～9％(g/v)、BA(0.2～4)mg/L、Kt(0～4)mg/L、NAA(0.1～1)mg/L、GA(0.1～2)mg/L、ABA(0.1～2)mg/L；2)所述转化受体材料的继代增殖培养过程是指挑选初生、鲜黄的胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基内进行继代增殖培养，培养室温度保持在24～28℃，暗培养，20～30天继代1次；所述胚性愈伤组织继代增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D(0.1～4)mg/L、BA(0～4)mg/L、KT(0.1～3)mg/L、NAA(0～3)mg/L、GA(0～2)mg/L、TDZ(0～2)mg/L；3)所述遗传转化过程是指利用基因枪或农杆菌介导法，以继代增殖的胚性愈伤组织为受体进行遗传转化；4)所述抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程是指经过转化及筛选过程，会从褐化的胚性愈伤组织内再生鲜黄的抗性胚性愈伤组织，将抗性胚性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代增殖培养基上进行多次继代，以增加抗性胚性愈伤组织的数量，从而大大增加诱导出抗性胚状体的数量；5)所述继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程是指将经多次继代的抗性胚性愈伤组织转入胚状体诱导培养基上诱导出胚，并使其进一步发育成成熟胚和成苗；所述胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，其中大量元素减至1/5～1/2，微量元素增加1～2倍，并添加水解酪氨酸50～400mg/L、麦芽糖2～9％(g/v)、BA(0.2～3)mg/L、KT(0～3)mg/L、NAA(0.1～1)mg/L、GA(0.1～2)mg/L、ABA(0.1～2)mg/L。