[发明专利]利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法

摘要

本发明涉及利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法，有效解决主要抗原区蛋白的制备，用于防止伪狂犬病毒对猪的危害问题，其解决的技术方案是，利用引物及伪狂犬病毒基因组DNA合成gE基因，对gE基因进行克隆，经连接产物和平板得白色菌落，再利用其菌落制得含有gE基因的质粒，再进行gE基因抗原区蛋白进行合成得目的片段和载体片段，混合，加入大肠杆菌进行克隆得含有gE基因的阳性重组菌，再接种于培养液中培养得gE基因主要抗原区蛋白，该方法先进，易操作，其产品使用效果好，成本低，无毒副作用，是猪病诊断防治上的一大创造。

主权项

1.一种利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法，其特征在于，由以下步骤实现：一、引物的设计与合成PCR引物的设计根据伪狂犬病毒MinA株gE基因的核苷酸序列，利用DNAStar和Primer5.0软件设计1对包含gE基因主要抗原表位区段的引物，上游引物(P1)带有BamHI酶切位点，下游引物(P2)带有HindIII酶切位点，上、下游引物之间所扩增片段包括gE基因主要抗原区630个碱基；二、伪狂犬病毒基因组DNA的提取：将MinA株伪狂犬病毒接种于PK-15细胞，待完全病变后，收集细胞悬液，10000r/min离心数秒，取沉淀液用适量细胞裂解液悬浮，加入蛋白酶K至最终质量浓度为100mg/L，在50℃作用3h，加入等体积的饱和酚，4℃，10000r/min，离心15min，重复2次；再用等体积的氯仿抽提一次，取上清液加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀3h；12000r/min离心10min；用70％的乙醇洗涤沉淀，自然干燥后加入含有Rnase的高纯水溶解得DNA，备用；三、gE基因主要抗原区的获取将上述基因组DNA在沸水浴中变性煮沸10min，取变性的DNA作为模板，反应体系为50μL，其中2×PCR缓冲液25μL，dNTPs 8μL，上游引物、下游引物浓度为20pmol/μL，各为1μL，Taq酶0.5U，94℃预变性1min；94℃预变性30s，50℃预变性30s，72℃预变性2min，如此30个循环，得gE基因；四、gE基因的纯化用DNA快速回收试剂盒回收DNA，DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，于长波紫外灯下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入一无菌的1.5mL的EP管中，加入3倍体积的溶胶液，于56℃水浴5-10min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化。然后将溶化的液体转至收集管的UNIQ-10柱中，于室温静置2min，13000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，用洗涤液洗两次，最后13000r/min离心2min，将回收柱转至一干净的1.5mL EP管中，加30uL TE洗脱，于室温放置2min，13000r/min离心1min，收集管中，即为纯化gE基因的DNA，备用；五、对gE基因进行克隆将纯化的gE基因3μL与pGEM-T Vector1μL、2×Ligation Buffer5μL和Ligase1μL混合16℃反应16-18小时，得连接产物；再对连接产物进行转化，在转化前2-4h于LB平板上涂X-gal，浓度为40uL 20mg/mL，和IPTG浓度为7uL 10mg/mL，正放于37℃温箱中，使X-gal和IPTG充分吸入琼脂中，然后按下列步骤进行：(1)取10μL连接产物无菌条件下加入已放置12～24h的JM109感受态细胞中，混匀后冰浴30min；(2)42℃水浴，热激90s，冰浴3min使冷却；(3)无菌加入800μL预热至37℃的LB培养液的瓶中，37℃、150～210r/min振荡1h，复苏培养1h；(4)5000r/min离心5min，无菌弃部分上清液；(5)混匀剩余的培养液和细胞沉淀，均匀涂布于含氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB琼脂平板上；(6)倒置平皿于37℃培养箱培养12～16h后，置平皿于4℃使蓝色充分显现，挑白色菌落，备用；六、提取质粒pT630：(1)用无菌牙签从LB平板挑取白色单个菌落，接种于3mL含氨苄青霉素LB培养液中100μg/mL，37℃240r/min振动12～16h，同时挑取蓝菌落提质粒作对照；(2)无菌移取1.5mL菌液置Eppendorf管中，12000r/min离心1min，弃上清液；(3)每管加入100μL预冷的溶液I，用涡旋器振荡悬浮；(4)加入200μL新配制的溶液II，温和倒置3～4次混匀，然后冰浴放置5min；(5)加入150μL预冷的溶液III，颠倒混和几次，冰浴放置5min；(6)12000r/min离心8min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加入500μL Tris饱和酚振荡抽提；(7)12000r/min离心5min，转移上层水相至一新管中，用体积比的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1振荡抽提；(8)12000r/min离心5min，上层水相加入2倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀30min以上，12000r/min离心10min；(9)沉淀用冰冷的70％乙醇洗涤，离心除去残余乙醇，置室温自然干燥；(10)用30μL含RNA酶浓度为20μg/mL的TE液pH8.0，溶解得含有gE基因的质粒PT630，备用；所说的溶液I为50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCL(PH8.0)、10mmol/L EDTA(PH8.0)制成；所说的溶液II为0.2mmol/LNaOH、1％SDS(新鲜配制)制成；所说的溶液III为5mmol/L乙酸钾60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml制成；所说的TE液为1mmol/L EDTA、10mmol/L Tric-HCL(PH8.0)制成；七、gE基因抗原区蛋白的合成：取质粒pT630和pET-28a载体质粒各10μL于1.5mL Eppendorf管中，加入10×PCR buffer 3μL，BSA 2μL，BamHI1.5μL和HindIII 1.0μL，灭菌水加至30μL置37℃水浴消化3h，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳重组质粒和载体的酶切产物，切下所需的目的条带，用Agarose Gel DNA ExtractKit分别回收纯化目的片段和载体片段，备用；八、对目的片段与载体的连接转化：取目的片段5μL、载体片段1.5μL混合后，加入10×Ligationbuffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL浓度为3U/μL，灭菌水补至10μL，混匀后置16℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌BL2中进行克隆，得含有gE基因的阳性重组菌；九、将阳性重组菌10μL接种至3mL 2×YT培养液中浓度为100μg/mL Amp，37℃振摇16-18小时，取培养物200μL接种于20mL 2×YT培养液中，剧烈振摇至OD600为0.6～1.0时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，37℃诱导表达，获得gE基因主要抗原区蛋白。