[发明专利]一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法

摘要

本发明公开了属于微生物学与分子生物学技术领域的一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法。称取一定的土壤样品于离心管中，加入磷酸缓冲液，旋涡振荡后离心分离出洗涤后的土壤样品。向洗涤后的土壤样品中加入裂解液并混匀。然后加入蛋白酶K和小玻璃珠，振荡后加入十二烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min后在水浴中振荡1h，离心分离出上清液。向收集到的上清液中加入KSCN溶液，水浴振荡15mim后离心分离出上清液。将收集到的上清液加入到离心纯化柱中，然后离心弃去液体。向离心纯化柱中加入洗涤液，离心弃去液体。然后向离心纯化柱中加入洗脱液，在水浴中放置2min，离心后收集离心管中液体即为纯化的土壤微生物DNA溶液，在-20℃保存备用。本发明具有提取方法操作简单，适用性强等特点，提取的土壤微生物DNA可直接应用于分子操作，来解析土壤微生物群落的结构。

主权项

1.一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法，其特征在于，该技术的具体步骤如下：(1)称取2.0g土壤样品于10ml离心管中，加入5ml 0.1M磷酸缓冲液(pH 9.5)，旋涡振荡5min，在11000r/min条件下离心10min，弃去上清液。按照上述方法对分离出的土壤再洗涤2次。(2)向由步骤(1)得到的土壤中加入5ml裂解液后混匀。裂解液的组成为：0.1～0.3MTris-HCl，0.05～0.15M EDTA，1.0～1.5M NaCl，pH 8.0～8.5，十六烷基三甲胺(0.5～1.5％)。然后加入1.5mg蛋白酶K和4g小玻璃珠，在50℃条件下振荡30min后加入1ml十二烷基硫酸钠溶液(100g/L)，旋涡振荡5min后在65℃条件下水浴振荡1h，在11000r/min条件下离心10min，收集上清液得细胞裂解液。(3)向由步骤(2)得到的细胞裂解液中加入1ml浓度为10M的KSCN溶液(pH值为6.0～6.5)，在35℃条件下水浴振荡15min，在11000r/min条件下离心10min，收集上清液。(4)将由步骤(3)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中，在11000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体。重复这一过程，直至所有由步骤(3)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化。(5)向经步骤(4)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗涤液，洗涤液的组成为：10ml4M NaAc与90ml无水乙醇混合后调pH值至7.5。在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。重复这一过程1次，即向该离心纯化柱中再次加入0.7ml洗涤液，然后在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体。(6)向经步骤(5)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗脱液，洗脱液的组成为：10～15mM Tris-HCl，1.0～2.0mM EDTA，pH 8.0。在65℃水浴中放置2min，在11000r/min条件下离心5min。将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在65℃水浴中放置2min，在11000r/min条件下离心5min。离心管中液体即为土壤微生物DNA溶液，在-20℃保存备用。