[发明专利]一种提取橡胶树树皮组织全蛋白的方法

摘要

本发明属于植物生物化学领域，涉及一种从橡胶树树皮组织中提取蛋白质样品的方法。特点是：采用改进的三氯醋酸(TCA)－丙酮沉淀法(先抽提后沉淀)结合双乙法提取植物树皮组织中的全蛋白，不仅可以提高样品的得率，还可以有效去除酚和色素等杂质。本发明可以为与树皮有关的研究提供高质量的蛋白质样品。

主权项

1.一种高效提取橡胶树树皮组织中总蛋白的方法，包括树皮样品采集和预处理、蛋白质提取和定量，其特征是：1)树皮样品的采集和预处理选择待采集样品的植株，用锋利的小刀刮去采集部位的树皮周皮，然后将树皮分割为若干小块，划割深度到木质部；用刀片撬起树皮，并用锡箔纸包住，做好标记，然后迅速冰浴或者置液氮中，带回实验室，用刀将树皮切成薄片，-70--80℃保存备用；2)蛋白质提取采用改进的三氯醋酸-丙酮沉淀法结合双乙法提取植物树皮组织中的总蛋白；具体操作流程为：(1)将干净研钵、包含10％TCA的丙酮溶液A以及丙酮置于-20℃预冷；(2)称取一定量的样品置于液氮中冷却；(3)用液氮荡洗研钵1-2次，然后将样品置入研钵中，加入样品的质量的0.5％-2％PVPP，然后加液氮研磨树皮样品10-30min，至细粉末状，将粉末盛装于离心管；(4)按1∶10-20(w/v)的比例向粉末中加入蛋白抽提液1，w是重量，单位为克、v是体积，单位是毫升，蛋白抽提液1pH＝8.5、配方为：4-7M尿素，0.5-2M试剂A，0.5-2％CHAPS，0.5-2％两性电解质载体(pH3.5-9.5)，40mM Tris，％均为质量百分比，M为摩尔，mM为毫摩尔；然后加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5-10min；(5)加入DTT至终浓度为10mM，超声5min，室温放置1h或者37℃孵育1h，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白；(6)4-10℃，30,000-40,000g离心10-30min，收集上清液；(7)向上清液中加入相当于5-10倍体积(w/V)的溶液A，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5min；加DTT至终浓度10mM，超声1min，于-20℃下静置2-15h后，4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清得到沉淀A；(8)沉淀A用冰浴丙酮重悬浮，冰浴丙酮体积是沉淀A的5-10倍，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5min；加DTT至终浓度为10mM，摇匀，于-20℃下静置0.5-2h后，4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清得到沉淀B；(9)重复步骤8一至两次，得到沉淀C；(10)取出沉淀C真空干燥或置超净工作台风干5-10min，以除尽有机溶剂；所得干粉末置-70--80℃保存备用或接下一步；(11)按1∶10-20(w/v)的比例向干粉末中加蛋白抽提液2，蛋白抽提液2pH＝8.5、配方：7-9M尿素，0.5-4％CHAPS，0.5-2％两性电解质载体、pH3.5-9.5，40mM Tris，然后加入PMSF和EDTA至终浓度为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5-10min；加DTT至终浓度10mM，超声1-5min，室温放置1-2h或者37℃孵育1-2h，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白，4-10℃、30,000g-40,000g离心10-30min，上清为蛋白溶液A；(12)向蛋白溶液A中加入TCA粉末至终浓度为12％，充分摇匀使TCA溶解，4-10℃放置30min-2h；(13)4℃、30,000-40,000g离心10-30min，得到沉淀D，取沉淀D用4℃预冷的10-20倍体积样品的乙醇∶乙醚(1∶1)重悬，于-20℃下静置0.5-2h；(14)4℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清；得到沉淀E，取出沉淀E真空干燥或置超净工作台风干5-10min，以除尽有机溶剂；(15)按1∶5-20(w/v)的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液2，然后加入PMSF和EDTA至终浓度为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5-10min；加DTT至终浓度10mM，超声2-5min，然后4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，上清即为所需的蛋白溶液B；(16)蛋白溶液B用1.5mL eppendorf离心管分装，-70--80℃保存备用；3)蛋白质定量采用Bio-rad公司的蛋白质定量试剂盒对所获得的样品进行定量。