[发明专利]一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法，属于生物技术与组织工程领域。其特征是不添加血清、只添加细胞因子和滋养细胞，用海藻酸钙壳聚糖胶珠将滋养细胞包埋起来，结合微载体与旋转壁式生物反应器技术实现脐血造血干细胞与间充质干细胞的共同培养，并分离、收获这两种脐血来源的干细胞。本发明的效果和益处是微载体为脐血间充质干细胞提供了粘附表面，使间充质干细胞实现贴壁动态悬浮培养；旋转壁式生物反应器不仅为造血干细胞提供了悬浮生长环境，还有效降低了流体剪切力对造血干细胞造成的损伤；滋养细胞可以滋养胶珠外部的脐血干细胞，不仅起到部分替代血清的作用，还利于不同细胞之间的分离与收获。

主权项

1.一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法，其特征在于以下步骤：(1)分离人脐血单个核细胞：脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，脐血采集量平均为50～100mL，密度梯度离心分离得到单个核细胞，用IMDM基础培养基1000rpm，5min离心洗涤，调整细胞密度备用；(2)脐血单个核细胞与玻璃包被的聚苯乙烯微载体在六孔板内静止孵育24小时：玻璃包被的聚苯乙烯微载体经不含Ca2+和Mg2+的PBS缓冲盐溶液处理后，115℃下高压灭菌15分钟，铺满六孔板每孔底面，接种入新鲜分离得到的密度为1×107cells·mL-1的脐血单个核细胞，静止孵育24小时；(3)提供滋养细胞：滋养细胞为人脂肪组织来源的脂肪干细胞，以5×104cells·mL-1的密度接种于含体积百分比浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，当细胞在培养瓶底面积达80％融合时，加入质量百分比浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行常规传代培养；(4)海藻酸钙壳聚糖胶珠包埋滋养细胞：将质量百分比浓度为1.0％的海藻酸钠溶液与密度为6×105cells·mL-1的脂肪干细胞悬液以2∶1体积比混合后，经5# 针头逐滴滴加至质量百分比浓度为3.0％氯化钙溶液中，反应8分钟，制得直径为1.0～1.5毫米的包埋有脂肪干细胞的海藻酸钙胶珠，PBS缓冲盐溶液冲洗后，再与质量百分比浓度为1.0％壳聚糖交联反应8分钟，将交联反应后的包埋有脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠用PBS缓冲盐溶液冲洗后备用；(5)准备旋转壁式生物反应器：将旋转壁式生物反应器各个部件清洗干净后，浸泡在体积百分比浓度为75％的酒精溶液中过夜，再用超纯水冲洗干净；将装配好的旋转式细胞培养系统、连接好的管路、充氧器分别包裹并于121℃下高压灭菌30分钟，烘干备用；(6)旋转壁式生物反应器内共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞：将脐血单个核细胞与玻璃包被的聚苯乙烯微载体在六孔板内静止孵育24小时后，与包埋脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠混合，加入IMDM培养基，调整脐血单个核细胞密度至5×105cells.mL-1，微载体浓度为5mg.mL-1，脐血单个核细胞与脂肪干细胞的细胞数比例为5∶1，加入细胞因子组合SCF 15ng·mL-1，FL 5ng.mL-1，TPO 6ng.mL-1，IL-315ng.mL-1，G-CSF 1ng.mL-1，GM-CSF 5ng.mL-1，接种至旋转壁式生物反应器中，37℃、5％CO2、20％O2、饱和湿度条件下共同培养12天；(7)分离海藻酸钙壳聚糖胶珠与脐血干细胞，收获并分离脐血造血干细胞与间充质干细胞：采用20目不锈钢筛网截留包埋脂肪干细胞的海藻酸钙壳聚糖胶珠，收集滤过液——脐血造血干细胞与粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微载体上的间充质干细胞混合悬液，采用自由沉降法分离并收获悬浮的脐血造血干细胞与粘附在玻璃包被的聚苯乙烯微载体上的间充质干细胞。