[发明专利]一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒

摘要

本发明提供一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒。通过自行设计特异性引物PSX1/PSX2，提取病毒RNA并反转录为cDNA，利用PCR方法检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp。该专用试剂盒，与现有技术相比，具有很强的特异性、敏感性，与病毒分离和IPMA方法相比符合率可达90％以上。该引物对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒的扩增结果均为阴性，能够区分NSP2变异株与传统株；该方法可检出12.8ng/L的PRRSV，可广泛用于临床高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株的检测。

主权项

1.一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒，其特征在于用于临床高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株的检测的特异性引物PSX1/PSX2，特异性扩增PRRSV NSP2变异株，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp，制备步骤如下：1)试剂盒采用的引物为PSX1：5’-TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3’PSX2：5’-GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3’，退火温度为54.5℃，采用28个循环，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp；2)病料的处理：将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用无菌细胞培养液1∶4倍稀释，取病毒悬液-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液-80℃保存备用。3)病毒RNA的提取①取研磨液300μL加入600μL RNAout，振荡混匀室温静置5min；②加入200μL氯仿用力颠倒，离心管混匀后静置5min，12000rpm离心10min。③取上清，加入500μL异丙醇，振荡混匀后，室温放置10min，12000rpm离心10min。④轻轻弃去上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500rpm离心5min。⑤弃上清，室温静置5-15min，使RNA沉淀干燥。⑥加入10μL的DEPC水溶解RNA，用于反转录。4)反转录取提取的RNA7μL，Oligo(dT)1μL 70℃作用10min，后于冰上加入5×buffer4μL、dNTP Mixture 3μL、Rnase Inhibitor 1μL、ddH2O 3μL、M-MLV 1μL，42℃水浴1h。用下游引物PSX2进行反转录。以此合成的eDNA为模板进行PCR反应。5)聚合酶链式反应(PCR)10×反应缓冲液 5.0μLdNTP(2.5pMol/μL) 4.0μLPrimer(+)(25pMol/μL) 1.0μLPrimer(-)(25pMol/μL) 1.0μLMgCl2(25mMol) 4.0μLcDNA 5.0μLTaq DNA聚合酶(5u/μL) 0.5μL无菌H2O 加至 50.0μL6)反应条件为：(1)95℃5min；(2)94℃1min，54.5℃1min，72℃1min，共28个循环(3)72℃5min。PCR扩增产物于-20℃保存。1.6电泳：电压100V电泳40min，取凝胶在含10mg/mL的溴化乙锭(EB)水溶液中染色15min，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。