[发明专利]ATL肽的固相合成方法

摘要

本发明公开了一种ATL肽的固相合成方法。采用MBHA树脂作为固相载体，首先在该树脂上连接保护赖氨酰基Boc－Lys(2－Cl－Z)，采用Boc保护氨基酸的程序接肽法完成ATL的合成，用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰，得到全保护的肽树脂；用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基，最后用三氟甲磺酸脱除侧链保护基团，并切割树脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相纯化该粗制品，甲醇－水梯度洗脱方法分离纯化，得ATL肽精制产品。本发明的方法条件具有单步缩合反应产率高，副产物少，最终粗品纯度高，杂质含量少，操作简单易行，总收率高的特点。

主权项

1.一种ATL肽的固相合成方法，包括下列步骤：1)以MBHA树脂为固相载体和起始原料，在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接保护氨基酸，制备H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂(1)向MBHA树脂中加入5％三乙胺DCM溶液洗2～3次；再用二氯甲烷、乙醇交替洗树脂2～3次，抽干；(2)向上述树脂中加入1～5当量Boc-保护氨基酸，1～5当量的HOBt，而后加入1～5当量的N，N-二环己基碳二亚胺，室温下搅拌1～6小时，抽干，得Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂；其中，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合液溶解，所述N，N-环己基碳二亚胺用二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合液溶解；(3)树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗3次，抽干；(4)树脂用50％三氟醋酸/二氯甲烷洗1～2次；(5)树脂用二氯甲烷洗2～3次，得H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂；2)用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰将50±2当量的乙酸酐DMF溶液加入H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂中，室温搅拌5～6小时，抽干；树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗2～3次，抽干，得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；3)用哌啶脱除Trp的甲酰基侧链保护基向Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入20％哌啶/DMF溶液，室温搅拌反应20～30分钟除Trp的甲酰基保护基，抽干，二氯甲烷，乙醇交替洗涤2～3次后，得到除Trp外的ATL树脂：Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；4)切割反应脱除侧链保护基团并切割树脂以10ml/g树脂的量将切割试剂加入到Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中，冰水浴下搅拌反应3小时后，过滤，收集滤液，用三氟醋酸洗涤滤除的树脂，洗涤液与滤液合并后浓缩，之后加入其100～150倍体积量的冷乙醚，即析出大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；其中：所述切割试剂是体积配比为：三氟醋酸∶三氟甲磺酸∶硫代苯甲醚∶乙二硫醇＝80∶8～9∶8～9∶4～5的混合溶液；5)ATL肽粗品的纯化ATL肽粗品用5％醋酸水溶液溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后，直接上样到反相C18键合硅胶装填色谱柱，采用梯度6～9％甲醇-水流动相进行梯度洗脱分离，收集目的组分，浓缩后，冷冻干燥，得到纯ATL肽。