[发明专利]半滑舌鳎雌性特异分子标记及其应用

摘要

一种半滑舌鳎雌性特异分子标记及其应用，包括筛选方法，含半滑舌鳎基因组DNA的提取，基因组DNA的AFLP分析和雌性特异分子标记的筛选；还包括半滑舌鳎雌性特异分子标记的克隆与序列，含雌性特异分子标记的回收，雌性特异分子标记的克隆和雌性特异分子标记的序列；再包括一种雌性特异分子标记的应用，应用于无损伤鉴别半滑舌鳎的遗传性别，即采集待测半滑舌鳎鱼基因组DNA，根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，分别设计3对特异引物，采用其中任意1对雌性特异引物进行PCR扩增，就可以对半滑舌鳎鱼进行遗传性别鉴定。具有先进、高效、准确、可靠的特点，在半滑舌鳎单性苗种生产中具有重要应用价值，并在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有广阔应用前景。

主权项

1.一种半滑舌鳎雌性特异分子标记的筛选方法，包括半滑舌鳎基因组DNA的提取，基因组DNA的AFLP分析，雌性特异分子标记的筛选，其特征是：1)、半滑舌鳎基因组DNA的提取：血液基因组DNA的提取抽取半滑舌鳎鱼血液经离心去除上层血浆，溶解血细胞沉淀，去除上清液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE缓冲液消化血细胞直至沉淀物溶解为组织液；再依序经饱和酚抽提；饱和酚、氯仿和异戊醇混合液抽提；以及氯仿和异戊醇混合液抽提；无水乙醇沉淀DNA；离心，去除上清液，收集DNA沉淀，经70％乙醇洗涤和自然干燥，用TE缓冲液溶解DNA沉淀，将DNA保存在-20℃备用；鳍条基因组DNA的提取采集半滑舌鳎鱼鳍条，经剪碎后用含蛋白酶-K的TENS裂解液消化，高盐法提取基因组DNA，收集DNA沉淀，经70％乙醇洗涤和自然干燥，用TE缓冲液溶解DNA沉淀，将DNA保存在-20℃备用；2)、基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤：第一步对DNA模板进行酶切；第二步是将特异接头连接到酶切片段上；第三步是进行预扩增；第四步是进行选择性扩增；第五步是电泳分析；所述的对DNA模板进行酶切的方法是：先用EcoRI/MseI酶混合物消化80-110ng模板DNA 4-6小时，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶；所述的特异接头连接到酶切片段上的方法是：向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4 DNA连接酶，20℃孵育12-20小时；所述的预扩增的方法是：将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个A或者C的选择性碱基的引物混合物，进行PCR预扩增；所述的选择性扩增的方法是：将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板；用荧光标记的MseI引物和EcoRI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基；向PCR扩增产物中加入适量的上样液，于94℃变性3分钟后立即置于冰上待用；总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；所述的电泳分析的方法是：将变性好的扩增产物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件：电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时；然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析；3)、雌性特异分子标记的筛选：用从商业公司购买的8个M序列和8个E序列AFLP引物，形成64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，其中2个引物组合产生了3条雌性特异的DNA片段，这些DNA片段在雄性个体基因组中不存在：其中，序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3’和5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’的引物组合M-CAA和E-ACT扩增出1条长度为781-791bp的雌性特异DNA片段；序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’和5’-GACTGCGTACCAAT TCAGC-3’的引物组合M-CTG和E-AGC扩增出2条雌性特异DNA片段，一条为460-468bp，另一条为130-136bp；将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的DNA片段作为雌性特异分子标记。