[发明专利]一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光PCR检测方法

摘要

一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光PCR检测方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明包括包被原、免疫原、和抗体的制备，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，两种粒径的金纳米粒子制备，两种金纳米探针的制备，包被原的固定，流动注射系统中的免疫反应，实时荧光定量PCR检测和待测样品的检测；本发明大大提高了微囊藻毒素-LR检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，而且以磁性粒子作为固相载体，具有清洗和分离方便，操作简单的优点，用DNA修饰的金纳米粒子作为探针代替传统的HRP进行免疫反应，简化了反应的条件。

主权项

1. 一种微囊藻毒素-LR的免疫荧光PCR检测方法，其特征是包括免疫原、包被原、和抗体的制备，包被原的固定，磁性纳米粒子的修饰，磁性纳米粒子与包被原的偶联，金纳米粒子的制备，金纳米探针的制备，流动注射系统中的免疫反应，荧光酶标板的包被和流动注射荧光PCR的检测：(1)免疫原的制备：将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；(2)包被原的制备：将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；(3)抗体的制备：将免疫源用常规方法制备特异性多克隆抗体；(4)磁性纳米粒子的修饰：将制备的Fe3O4种子用3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰；(5)磁性纳米粒子与包被原的偶联：(6)两种粒径的金纳米粒子制备；(7)两种金纳米探针的制备；(8)包被原的固定：将所得包被原与磁性微粒偶联并固定于玻璃微通道内；(9)流动注射系统中的免疫反应(10)流动注射荧光PCR的检测：利用间接竞争免疫检测将微囊藻毒素-LR和多克隆抗体通过玻璃微通道内，竞争结合后的多克隆抗体与经羊抗兔抗体及双链DNA共同修饰的金纳米探针反应，变性得到单链DNA并将其收集，收集得到的单链DNA进行实时荧光定量PCR检测，得到关于微囊藻毒素-LR的浓度与Ct值的标准曲线；待测样品测得的Ct值与得到的标准曲线进行比对，得到待测样品中微囊藻毒素-LR的含量。从而达到检测微囊藻毒素-LR的含量。