[发明专利]一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法

摘要

本发明涉及一种检测流感病毒的方法，尤其是一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法，属于医学监测技术领域。本发明是一种可以同时对甲(FluA)、乙(FluB)型流感病毒，包括H5N1亚型禽流感病毒进行分型鉴定的快速高效的检测方法。利用了液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，制作能够特异性识别H5、N1基因片段、甲型流感病毒的NP基因以及乙型流感病毒的HA基因片段的液相芯片。其优点是：能够对甲、乙型流感病毒，包括H5N1亚型高致病性禽流感病毒进行快速检测和早期诊断；并为开发其它各种亚型流感病毒的快速高效检测方法提供依据。其检测病毒种类多，反应时间短且灵敏度高的特性决定了本发明必将具有广阔的应用前景。

主权项

1. 一种借助液相芯片检测流感和H5N1亚型禽流感病毒的方法，其特征是包括以下步骤：步骤一设计引物和探针，依据现有核酸数据库中甲型流感病毒H5、N1和NP的基因节段序列以及乙型流感病毒中的HA基因节段序列进行同源性比对，根据保守序列，设计针对各基因的简并引物和特异性探针；所述简并引物为：FluA-Forward GAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATFluA-Reverse GGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCATH5-Forward GGTAACGGTTGTTTCGARTTCTATCAH5-Reverse ATAGACCAGCYACCATGATTGCCAGN1-Forward GGACYAGTGGGAGCAGCATAN1-Reverse TGTCAATGGTRAAYGGCAACTCFluB-Forward AAATACGGTGGATTAAATAAAAGCAAFluB-Reverse CCAGCAATAGCTCCGAAGAAA；所述特异性探针为：FluA-probe TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAH5-probe CCGCAGTATTCAGAAGAAGCN1-probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGCFluB-probe GCCATAGGAAATTGCCCAAT；步骤二合成及修饰引物和探针，在设计完成的特异性探针的5′端加上C12分子臂和氨基修饰，得到特异性检测探针，并对设计完成的简并引物中的所有反向引物进行生物素标记，得到特异性检测引物。步骤三制备液相芯片，将步骤二中的特异性检测探针与荧光微球偶联形成特异性检测微球，即液相芯片；步骤四RT-PCR反应，对甲型流感病毒H5、N1和NP以及乙型流感病毒中的HA进行多重PCR反应，得到PCR扩增产物，其中，所述4重PCR反应为引物不对称的RT-PCR反应，其中，正向引物的浓度范围是：0.01μM～0.6μM，反向引物的浓度范围是：0.05μM～0.6μM；步骤五PCR扩增产物与液相芯片杂交，将步骤四所得PCR扩增产物与步骤三中得到的液相芯片进行杂交，通过液相芯片检测系统检测芯片。