[发明专利]一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法

摘要

本发明提供了一种可同时筛选镇痛中药活性成分和确定其结合的阿片受体亚型的细胞膜色谱法，该方法包括如下步骤：白芷醇提液指纹图谱的建立；输精管平滑肌细胞的原代培养及传代培养；效应成分的结合与解离；高效液相色谱测定结合前后图谱变化。通过使中药作用于不同种属输精管平滑肌细胞，考查其解离液在高效液相色谱柱上的行为，并用阿片受体激动剂和阿片受体拮抗剂作参比，即可考查该中药活性成分与某种阿片受体亚型的亲和力。以输精管上的阿片受体作为镇痛药作用关键环节的筛选模型，除可对具有镇痛作用的中药进行活性成分筛选外，还可直接确定该活性成分与某种阿片受体亚型有亲和力，具有良好的应用前景。

主权项

1、 一种筛选镇痛中药活性成分的细胞膜色谱法，其特征在于包括如下步骤：(1)白芷醇提液指纹图谱的建立：称取20g白芷药材，加入160ml 95％乙醇，回流提取1～2h，挥干乙醇，残渣用甲醇溶解定容至20ml，从中取250μl用甲醇稀释至7.5ml，过0.45μm微孔滤膜，得到滤液即为白芷醇提液；吸取滤液20μl，采用高效液相色谱方法进行测定，得到白芷醇提液有效成分群指纹图谱，确定13个共有指纹峰；所述高效液相色谱分析条件：以甲醇-水为流动相系统，柱温30℃，进样量20μl，波长254nm，长度为250mm、直径为4.6mm的Lichrospher5-C18色谱柱，流动相梯度：0～5min，5％～20％甲醇；5～15min，20％甲醇；15～20min，20％～70％甲醇；20～30min，70％甲醇；30～40min，70％～90％甲醇；上述均为体积百分比；所述白芷醇提液指纹图谱的13个共有指纹峰各相对保留时间分别为：1号峰：0.031～0.034； 2号峰：0.086～0.088；3号峰：0.607～0.649；4号峰：0.658～0.665； 5号峰：0.704～0.708；6号峰：0.730～0.739；7号峰：0.749～0.755； 8号峰：0.810～0.816；9号峰：0.842～0.847；10号峰：0.856～0.861；11号峰：1； 12号峰：1.085～1.087；13号峰：1.181～1.186；各共有指纹峰相对峰面积范围分别为：1号峰：0.005～0.061； 2号峰：0.016～0.132；3号峰：0.050～0.366；4号峰：0.010～0.135； 5号峰：0.03～0.148； 6号峰：0.006～0.153；7号峰：0.086～0.328； 8号峰：0.047～0.105；9号峰：0.018～0.059；10号峰：0.030～0.113；11号峰：1； 12号峰：0.251～0.492；13号峰：0.304～0.845；以上均以11号峰为参照；(2)输精管平滑肌细胞的原代培养及传代培养：取成年雄性小鼠或成年雄性兔的输精管，剥离内外膜组织，采取酶消化法在培养瓶中培养细胞；当细胞长满覆盖瓶底面积80％左右时，进行传代；(3)效应成分的结合与解离：将经3～10代传代的细胞消化得到的细胞悬液与步骤(1)获得的白芷醇提液等体积混合均匀，36～38℃温育0.5～24h后，离心去上清，用DMEM培养液洗涤细胞3～5次，得到均匀悬液，离心，弃上清液，得沉淀细胞；在沉淀细胞中加入pH2～6的PBS使细胞变性，离心，收集上清液并挥干，得解离物；(4)高效液相色谱测定结合前后图谱变化：将步骤(3)所得解离物用甲醇溶解，用高效液相色谱分析，所述高效液相色谱分析条件与步骤(1)的色谱分析条件相同；通过比较解离物指纹图谱和白芷醇提液指纹图谱中各吸收峰的变化，并分别用阿片受体拮抗剂和阿片受体激动剂作参比，确定白芷是否与阿片受体结合；与阿片受体特异结合的特征峰为7号峰、8号峰和10号峰；筛选出的白芷镇痛活性成分为7号峰、8号峰和10号峰；所述阿片受体拮抗剂为盐酸纳洛酮，所述阿片受体激动剂为盐酸哌替啶。