[发明专利]一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法

摘要

本发明涉及一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法。本发明建立一种快速简便的高通量人胸苷激酶(hTK1)免疫检测技术，用于hTK1的临床检测。主要通过戊二醛将hTK1共价固定于氨基硅烷化的超顺磁性纳米颗粒固定化载体表面，采用竞争性免疫分析方法，以辣根过氧化物酶为酶标记、对羟基苯丙酸为荧光底物，实现了对hTK1的测定。本方面采用的硅烷化的核壳型磁性纳米颗粒可均匀分散在液相中，具有固定均匀、特异性高、重现性好、反应速度快等特点，在外加磁场的作用下，可快速有效地实现核壳型磁性纳米颗粒的免疫复合物与反应液的分离与富集，分析方法操作简单、准确、灵敏、快速，易于实现自动化检测，可完成大批量的测试任务。

主权项

1.一种基于磁性纳米微粒的人胸苷激酶荧光免疫分析新方法，其特征在于，hTK1包被的核壳型磁性颗粒(hTK1-MP)的制备包括以下步骤：1)磁性纳米颗粒的制备：采用液相共沉淀方法，分别将一定浓度的FeCl3·H2O和FeCl2·4H2O在氨性溶液中共沉淀，静止分层并去掉上层清液后，立即加入浓度为20-30％的四甲基氢氧化铵溶液，再用超声法分散后，再用砂漏斗过滤，除去其中较大的磁性纳米颗粒，即可得到颜色为灰褐色、且磁性纳米颗粒大小均匀一致的溶液；2)磁性纳米颗粒的氨基硅烷化：吸取一定剂量的磁性纳米颗粒溶液、并加入至在100-200ml异丙醇溶液中；用超声法将磁性纳米颗粒进行分散；同时，边搅拌边加入3-6g聚乙二醇(PEG-4000)，继续搅拌10-20min后加入适量蒸馏水，然后加入0.1-0.3ml正硅酸乙酯(TESO)水解形成硅壳层；在特定磁场作用下，用无水乙醇和蒸馏水分别洗涤干净后，分散于无水乙醇中；再加入适量蒸馏水后，在不断搅拌下加入0.1-0.3ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，形成氨基化硅烷壳层；在特定磁场作用下，分别用无水乙醇和蒸馏水洗涤干净后，分散于pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，所得物质即为氨基硅烷化的磁性纳米颗粒(MNPs)；3)磁性纳米颗粒标记人类I型胸苷激酶(hTK1)：将上述氨基硅烷化的磁性纳米颗粒(MNPs)用戊二醛活化，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤干净后，再分散于相同的PBS中；然后，直接在此PBS溶液中加入一定剂量的hTK1(用基因克隆技术，在大肠杆菌中表达hTK1基因，制备得到hTK1的融合蛋白)，在一定条件下反应0.5-1.5h，即可将hTK1共价固定于MNPs上，得到hTK1包被的磁性纳米颗粒(hTK1-MNPs)；4)封闭：在hTK1-MP分散溶液中加入甘氨酸溶液反应1h，即可封闭磁性纳米颗粒表面的活性醛基；最后，用pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤干净后，再分散于相同的PBS中；5)保存：将hTK1-MNPs保存在4℃的冰箱中备用。