[发明专利]一种同时提取堆肥样品中PLFA和DNA的方法

摘要

本发明提供了一种从同一堆肥样品中同时提取和纯化磷脂脂肪酸PLFA和脱氧核糖核酸DNA的方法，该提取方法是以脂质提取方法为基础，在相分离后，脂质进入有机相，DNA留在水相及固相，最终实现PLFA和DNA的同时提取；本发明的优点是简化了堆肥样品脂质和DNA提取的程序，保证了样品信息来源的同一性，能较好地减小堆肥取样对检测方法造成的误差，同时，在样品量很少的情况下显得更有意义。

主权项

1.一种同时提取堆肥样品中的PLFA和DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：a.PLFA的提取a-1.称取堆肥样品于试管中，分别加入二氯甲烷、甲醇、磷酸盐缓冲溶液，依次加入的体积比为1∶2∶1；a-2.超声匀化后低温避光静置过夜；a-3.将上述试管离心分层，液相转移到新的玻璃管中，加入二氯甲烷和纯水，使得二氯甲烷∶甲醇∶磷酸缓冲液的体积比为1∶1∶0.9，用于继续提取PLFA，固相于-20℃下保存以提取DNA；a-4.将上一步液相静置24h后，转移水相于新的离心管a中用于沉淀DNA，将有机相过滤，去除可能残留的颗粒悬浮物，滤液用N2干燥后加正己烷溶解；a-5.将上一步正己烷溶解的脂质过硅胶柱，依次用正己烷、氯仿、丙酮、甲醇洗涤柱子，收集甲醇洗涤液，N2干燥；a-6.用甲醇和甲苯混合溶液溶解干燥后的脂类物质，所述混合溶液中甲醇∶甲苯的体积比为1∶1，加入KOH溶液水浴加热使其甲酯化，冷却至室温，加入醋酸中和过量的KOH，摇匀后加氯仿萃取，去水相，再加去离子水洗涤，使得有机相部分的无机物尽可能的溶解在水相，底部有机相为溶解在氯仿中的甲酯化PLFA；b.DNA提取b-1.取步骤a-3中所保存的固相物质，添加磷酸盐缓冲液洗涤去除样品中的腐殖酸；b-2.样品洗涤后添加DNA提取液和蛋白酶(Proteinase)K进行消化，其中，样品量∶DNA提取液∶蛋白酶K为1g∶1ml∶0.005ml；b-3.将上一步所得物质转移至离心管b中，并加入SDS，另外在步骤a-4中的离心管a中也加入SDS，两根离心管同时水浴消化细胞中的蛋白质，然后将含固相的离心管b离心分层；b-4.收集离心管b中的上清，转移到离心管a中，轻微混合；b-5.加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液至离心管a中，所述混合溶液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1，轻微颠倒混合后离心，吸取水相转移至新的离心管中；b-6.上一步水相中加入0.6倍体积异丙醇沉淀1h，然后离心；b-7.沉淀以冰预冷的乙醇重复洗涤后风干；b-8.加入TE缓冲液溶解DNA并置于-20℃下保存。