[发明专利]通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法

摘要

本发明涉及一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括1)：底物+草酸脱羧酶+醋酸缓冲溶液，30－37℃，反应0.5－1h；2)配制pH 7.3～8.5的含磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH、苹果酸脱氢酶的Tris－HCl缓冲液，30－37℃，温育，380nm处测A₁；3)在步骤2)中添加步骤1)反应液，30－37℃反应，380nm处测A₂；4)根据ΔA_380nm＝A₁－A₂计算NADH减少量，再根据反应原理计算生成二氧化碳的浓度，从而计算草酸脱羧酶的活力。本方法可靠，灵敏度高，与测定草酸脱羧酶的经典方法所测值相近，是一种很好的测定草酸脱羧酶酶活的方法。

主权项

1.一种通过测定二氧化碳浓度来计算草酸脱羧酶活力的方法，包括步骤：(1)第一步酶催化反应体系空白组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL 50mM草酸和0.1mL处理失活的草酸脱羧酶酶液待测样品组：混合0.3mL 200mM醋酸缓冲液、0.1mL 50mM草酸和0.1mL待测草酸脱羧酶酶液v第一步酶催化反应体系总体积V₂为0.5mL，反应pH为3.0～3.7，反应温度为30～37℃，反应时间T为30～60min；(2)第二反应体系空白组和待测样品组都为：1.0mL CO₂试剂其CO₂试剂的组成为8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的苹果酸脱氢酶的pH 7.3～8.5 Tris-HCl缓冲液；第二反应体系在30～37℃温育5～10min，380nm条件下测定A₁；(3)第三反应体系空白组：混合1.0mL CO₂试剂和0.01～0.1mL上述第一步酶反应空白组液V₃待测样品组：混合1.0mL CO₂试剂和0.01～0.1mL上述第一步酶反应待测样品组液V₃第三反应体系总体积V₁为1mL+V₃，30～37℃，5～10min，pH 7.3～8.5，380nm下测定A₂，计算ΔA＝A₁-A₂；(4)计算草酸脱羧酶活力U/mL一个酶活单位定义为在30～37℃，pH 3.0～3.7，一个大气压下，每分钟生成1μmol二氧化碳的量，体积酶活定义为每mL草酸脱羧酶酶液中的酶活力单位数，体积酶活单位为U/mL；公式(1)其中，ΔA_380nm＝ΔA_样品-ΔA_空白V₁——最后的反应液总体积(mL)T——第一步草酸脱羧酶反应时间(min)v——待测酶液样品体积(mL)V₂——第一步酶反应液总体积(mL)V₃——参加第三步反应的酶反应液体积(mL)d——比色皿光路直径(cm)ε₁——NADH在380nm处的吸收系数(1.33L·mmol^-1·cm^-1)。