[发明专利]一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法

摘要

本发明涉及一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法为：第一步，制备酶标抗原、黄曲霉毒素AFB₁标准溶液、样品稀释液、酶标抗原稀释液、洗涤液制备底物液a、底物液b、终止液即2mol/L硫酸液和提取液，第二步，进行待测液前处理、试剂准备、反应板试管编号、依次加入配置好的溶液、待测样液和终止液，反应板装入用黄曲霉毒素测定仪测定各孔的吸光度A值；将测得的吸光度A值，黄曲霉毒素测定仪内自动建立方程A＝MC+N回归计算，计算出样品中AFB₁的含量。本发明的优点是简便、快速、准确、灵敏度高。

主权项

1.一种准确、快速检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法为一.标准试样制备第一步，制备黄曲霉毒素AFB₁抗体包被反应板：将抗黄曲霉毒素AFB₁多克隆抗体用50mmol/L-100mmol/L，Na₂CO₃-NaHCO₃PH9.6缓冲液稀释至3-5μg/ml的包被液，加入到反应板的48或96孔的试管中，每孔加100-110μL，3℃-5℃冰箱放置过夜，弃去包被液冲洗2次-4次，每孔中加200-250μL含1％牛血清白蛋白BSA的100-110mmol/L、PH7.4磷酸盐PBS缓冲液封闭35℃-40℃放2-4小时弃其封闭液将包被板真空包装后置-15℃--25℃冷冻保存；第二步，制备酶标抗原：取0.5～1mg黄曲霉毒素B₁-羧甲基肟AFB₁-omixe溶于20％乙醇溶液中加入20-50mg乙二胺3.3-二甲胺丙基碳化二亚胺盐酸盐EDC·HCL搅拌反应30分钟-60分钟，再以磷酸盐PBS 0.01M、PH7.4溶液透析2天-4天，得到酶标抗原原液；第三步，制备黄曲霉毒素AFB₁标准溶液将10％-20％甲醇的磷酸盐PBS PH7.4溶液为溶剂配制0.1ng/ml-10ng/ml的AFB₁标准系列溶液；第四步，制备样品稀释液在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入10％-20％甲醇；第五步，制备酶标抗原稀释液在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入0.05-0.2％的牛血清白蛋白BSA；第六步，制备洗涤液在磷酸盐PBS PH7.4溶液中加入0.03％-0.07％的吐温-20TW-20；第七步，制备底物液a：在乙酸钠——柠檬酸缓冲液PH＝5.0中加入0.1％-0.4％四甲基联苯胺TMB；第八步，制备底物液b：在乙酸钠-柠檬酸缓冲液PH＝5.0中加入0.01-0.03％过氧化氢H₂O₂；第九步，制备终止液即2mol/L硫酸液；第十步，提取液即甲醇∶水为1∶1；二，检测第一步，待测液前处理，称取5g粉碎过20目筛的样品于磨口的50ml试管中，加入提取液20-30ml，加塞振荡5分钟-10分钟，过滤即为待测样液；第二步，试剂准备：在标准试样制备第二步准备的酶标抗原原液中加1-2ml酶标抗原稀释溶液，充分溶解，配成酶标抗原工作溶液；第三步，试管编号：根据实验需要将反应板框架上的试管编号，设定1号试管为仪器凋零试管，2-7号试管为黄曲霉毒素AFB₁标准对照试管，其余试管为样品试管；第四步，依次加入配置好的溶液及待测样液(1)，在1号试管中加入40-60μL样品稀释液，在2-7号试管中分别加入黄曲霉毒素AFB₁标准溶液40-60μL，在其余试管中分别加入待测样液；(2)，在1号试管中加入40-60μL酶标抗原稀释液，其余试管中分别加入40-60μL酶标抗原工作溶液，轻轻地振荡，使各试管中的反应物混匀；(3)，然后将反应板放入35℃-40℃恒温培养箱中孵育20分钟-40分钟；(4)，取出反应板，甩掉反应液，拍干，每试管加入200μL-300μL洗涤液，放置1分钟-3分钟后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板3-5次；(5)，在每试管中分别加入底物液a和底物液b各50μL，摇匀，将反应板放入35℃-40℃恒温培养箱中，显色10分钟-20分钟；(6)，取出反应板，在每个试管中分别加入终止液40-60μL，用黄曲霉毒素测定仪在360mm-450mm波长处测定各孔的吸光度A值；(7)，将测得的吸光度A值，黄曲霉毒素测定仪内自动建立方程A＝MC+N回归计算，计算待测样品孔A值与A_0ng/ml的比值，查标准曲线，可得到相应待测样液浓度C的常用对数值LgC，对其求反对数，可求得待测样液的AFB1浓度C，按下列公式计算出样品中AFB1的含量：式中：C----从标准曲线上查得的AFB₁的含量(ng/ml)V----样品提取液体积(ml)；D----样品稀释倍数；m----样品的质量(g)。