[发明专利]一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法

摘要

本发明公开了一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的PARP1基因、XRCC1基因、ERCC2基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供DNA损伤修复能力的遗传风险评估、相关疾病风险规避的个性化健康指导。本发明的优点是可在基因损伤发生前就采取干预措施，从而避免基因损伤，从而降低与基因损伤相关的如肿瘤疾病的发病率和死亡率；从分子机理上进行肿瘤发病机理的分析，可用于肿瘤分子流行病学调查和肿瘤防治措施的制定。

主权项

1.一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，其特征在于，其方法为：步骤1.检测的样品类型与采样方法：用采样拭在20-30被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上，以保证采集到足量的细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，共抽提20-30个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3：荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入5个反应孔，同时检测5个位点，即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1：Val762Ala、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2：Arg194Trp、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3：Arg399Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4：Lys751Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5：Asn312Asp；20-30个被测者样本就有100-150个反应孔，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔；每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan-MGB技术，进行检测试剂合成；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI TaqmanMGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl₂溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去离子水4.98μl、5个位点分别采用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC荧光探针(10μM，0.25μl)和FAM荧光探针(10μM，0.25μl)工具进行检测(详见下表)；将101-151个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将20-30个被测者样本检测5个点位的数据对号入座到5个图中，同时生成5张图，即多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQID NO1图；Val762Ala、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQID NO2图；Arg194Trp、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3图；Arg399Gln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4图；Lys7516ln、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5图；步骤4：SNP基因型分析将ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的5个表和一个NTC空白对照进行比较，每个位点理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、多聚ADP核糖转移酶(PARP1)SEQ ID NO1：Val762Ala在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴0.4-0.5、Y坐标轴：0.2-0.4区域为空白对照、X坐标轴：0.2-0.4、Y坐标轴：1.0-1.3区域为TT基因型、X坐标轴：0.7-0.9、Y坐标轴：0.7-1.0区域为TC基因型、X坐标轴：0.8-0.9、Y坐标轴：0.3-0.4区域为CC基因型，其中，CC为风险基因型，携带风险基因型时酶的活性降低，导致多种癌症的发生风险增加；(2)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO2：Arg194Trp在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴：0.1-0.2、Y坐标轴：0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴：0.1-0.2、Y坐标轴：0.9-1.1区域为CC基因型、X坐标轴：0.3-0.5、Y坐标轴：0.75-0.95区域为TC基因型、X坐标轴：0.5-0.6、Y坐标轴：0.5-0.6区域为TT基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时XRCC1活性降低，导致个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加；(3)、人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1)SEQ ID NO3：Arg399Gln在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴：0.1-0.2、Y坐标轴：0.3-0.4区域为空白对照、X坐标轴：0.1-0.2、Y坐标轴：2.1-2.2区域为TT基因型、X坐标轴：0.4-0.6、Y坐标轴：1.1-1.7区域为TC基因型、X坐标轴：0.8-1.0、Y坐标轴：0.4-0.5区域为CC基因型，其中，TT为风险基因型，携带风险基因型时个体的DNA修复能力下降，癌症的发生风险增加；(4)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO4：Lys7516ln在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴：0.0-0.1、Y坐标轴：0.2-0.3区域为空白对照、X坐标轴：0.05-0.15Y坐标轴：1.5-2.0区域为AA基因型、X坐标轴：0.7-0.9、Y坐标轴：1.4-1.6区域为AG基因型、X坐标轴：0.7-1.2、Y坐标轴：0.3-0.5区域为GG基因型，其中，AA和AG为风险基因型，携带风险基因型时基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，DNA上致癌损伤积累，癌症的发生风险增加；(5)、切除修复复合物2(ERCC2)SEQ ID NO5：Asn312Asp在检测结果图中，共有21-31个点，每个点代表一个被测者样本的检测结果，X坐标轴：0.1-0.2、Y坐标轴：0.4-0.5区域为空白对照、X坐标轴：0.0-0.1、Y坐标轴：2.3-2.8区域为TT基因型、X坐标轴：0.8-0.1、Y坐标轴：2.2-2.5区域为GT基因型、X坐标轴：0.8-1.0、Y坐标轴：0.4-0.5区域为GG基因型，其中，GT和GG为风险基因型，携带风险基因型时ERCC2参与构成的转录因子复合物性能弱化，癌症的发生风险增加；每一个被测者的5个点落在5个表上哪个区域，即可知道被测者DNA损伤修复能力的遗传风险；步骤5，根据检测结果给予个性化指导建议，主要有以下几点：一、避免过多、过强的紫外线照射：阳光中适量的紫外线照射对人体有益，但过多、过强的紫外线，尤其是紫外线灯等的照射，会引起胸腺嘧啶二聚体的形成，还可以引起DNA之间的交联，DNA与蛋白质的交联，甚至DNA链的断裂。紫外线对人的伤害主要限于皮肤；二、避免电离辐射引起的基因损伤：电离辐射可导致DNA分子的多种变化，如：碱基变化、脱氧核糖变化、DNA键断裂、DNA链交联等。这些辐射可能会引起癌症的发生。电离辐射广泛存在于人们的生活环境中，包括天然辐射和人造辐射。在日常生活中，应注意尽量避免接触含有放射性物质的东西，如夜光手表等；三、注意防止烷化剂引起的DNA损伤：烷化剂种类很多，如芥子气、硫酸二乙酯等。很多烷化剂都是致癌物。现在工业中大量使用烷化剂，应尽量避免接触。烷化剂引起的损伤有碱基烷基化、碱基脱落、DNA断链、DNA链交联等；四、戒烟酒并注意营养补充：吸烟和饮酒会抑制DNA的修复，缺乏叶酸会增加DNA双链打开的可能性，而这不容易修复，往往造成DNA永久的损伤。在日常生活中，应注意多补充富含各种营养元素的新鲜水果蔬菜及菜花、酵母等富含叶酸的食物。