[发明专利]大熊猫西氏蛔虫抗原的制备及其应用

摘要

本发明公开了大熊猫西氏蛔虫抗原的制备及其应用，属大熊猫西氏蛔虫的防治及检测领域。包括设计出西氏蛔虫抗原基因引物；采用RT－PCR法将蛔虫总RNA逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增出目的产物；将纯化的目的产物与pMD18－T载体连接，转至DH5α，感受态细菌；经平板筛选培养，选取阳性重组克隆，培养后测序出抗原基因为Bs－Ag1基因、Bs－Ag2基因、Bs－Ag3基因。再进行重组质粒构建、诱导表达和重组蛋白纯化，将测序正确的重组质粒，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，进行蛋白的大量表达。其产物经检测、免疫试验以及对试验动物抗体IgG的ELISA检测分析：大熊猫西氏蛔虫抗原Bs－Ag1、Bs－Ag2和Bs－Ag3基因可以作为蛔虫制备基因工程疫苗的侯选基因，其重组蛋白Bs－Ag1、Bs－Ag2和Bs－Ag3具有良好的反应原性，可以用来构建以ELISA方法检测感染大熊猫蛔虫。

主权项

1、大熊猫西氏蛔虫抗原的制备及其应用，其特征在于：大熊猫西氏蛔虫抗原按照下述步骤制备：(1)以大熊猫蛔虫成虫或二期幼虫为模板，用RNA试剂盒法提取大熊猫蛔虫总RNA。(2)根据猪蛔虫的抗原基因序列设计大熊猫蛔虫Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因引物，所述引物对的序列为：上游：CGCGGATCCcaaggacctcaaggaccaccac(含BAMHI酶切位点)；下游：5-CCCAAGCTTCTAgccttgcatctctttttg-3(含HINDIII酶切位点)。(3)采用RT-PCR法将大熊猫总RNA逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出目的产物Bs-Ag1、Bs-Ag2和Bs-Ag3基因。(4)将回收纯化的目的产物直接与pMD18-T载体连接后，转化至受体细胞大肠杆菌K-12的衍生菌DH5α。感受态细菌，经含有氨苄青霉素的平板筛选培养，培养于3ml LB培养基中，培养14--16h后，取2μl培养的重组克隆菌液为模板，经过菌落PCR鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测。选取阳性重组克隆，小规模扩大培养后，进行测序。