[发明专利]人血清中血管生成素检测方法及其应用

摘要

本发明属于生物医学工程中的免疫学技术领域，具体涉及人血清中血管生成素检测方法及其应用。按常规方法表达并纯化人血管生成素蛋白，制备人血管生成素抗体，为血管生成素血清检测提供实验基础。分别采用竞争ELISA法和双抗体夹心ELISA法检测血清中的血管生成素，采用了兔抗人血管生成素多克隆抗体进行竞争ELISA，鼠抗人血管生成素单克隆抗体和兔抗人血管生成素多克隆抗体进行夹心ELISA，检测人血清中的血管生成素，棋盘滴定法优化ELISA实验条件，确定最适血清稀释倍数和抗原抗体稀释倍数。联合两种检测方法，分析人血清血管生成素的检出率。可以相互补充，提高检出率。

主权项

1、双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素的方法，其特征是：1)重组人血管生成素蛋白的表达、纯化利用RT-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段，测序正确后克隆入表达载体pET28-a(+)中并转化于E.coli BL21宿主菌中，经IPTG诱导，表达了N端融合6个组氨酸标签6His-tag的血管生成素融合蛋白，利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2+高亲合力结合的性质，经镍柱纯化，获得了高纯度的血管生成素融合蛋白；2)人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体的制备按常规方法制备人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体；3)双抗体夹心ELISA法检测血清中血管生成素用人血管生成素单克隆抗体和多克隆抗体进行夹心ELISA检测人血清中的血管生成素：(1)ELISA实验条件的确定棋盘滴定选择优化的ELISA实验条件，以血管生成素单抗说明书建议浓度2μg/mL包被96孔酶标板，包被液为0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液，0.16g Na2CO3，0.29g NaHCO3溶于100ml水中，湿盒中4℃温育过夜；次日，用含0.05％的Tween20，pH7.4PBST缓冲液洗涤3次，每次3分钟，再用PBS液洗涤两次，每次2分钟；每孔加入100μl含5％脱脂奶粉的PBS缓冲液进行封闭，置于湿盒中37℃温育1h，按如上方法洗涤；按倍比稀释纵列加血清，第一列稀释倍数为5倍，此后各列稀释倍数依次为10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120、10240，每孔加入50μl置于湿盒中，37℃温育1h，洗涤；按倍比稀释横排加兔抗人血管生成素多克隆抗体，第一行稀释倍数为100，此后各行稀释倍数依次为200、400、800、1600、3200、6400，每孔加入50μl置于湿盒中，37℃温育1h，洗涤；加入1∶5000倍稀释的辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔50μl，37℃温育1h，洗涤；加入底物TMB，置室温显色12分钟，用2mol/L H2SO4溶液终止反应；在酶标仪上检测OD450/620的吸光值；不同稀释度的血清与不同稀释度的多抗进行组合，确定最适条件为血清稀释倍数为10倍，多抗的稀释倍数为800倍；以棋盘滴定法确定的ELISA最适条件对数百例健康人血清进行检测，选取临界值质控血清，以血管生成素系数来描述cut-off值，确定实验的cut-off值为1.4，血管生成素系数＝样本血清OD450nm/620nm/质控血清OD450nm/620nm；(2)患者血清血管生成素含量的测定利用双抗体夹心ELISA检测血清血管生成素水平，操作同上，检测时每块板上均加入阳性对照血清、阴性对照血清、临界值质控血清，结果以血管生成素系数表示，如果血管生成素系数大于或等于cut-off值1.4，则为血管生成素阳性，所有样本的检测均为平行双孔，结果取两孔平均值；。