[发明专利]细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法

摘要

本发明涉及一种细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法，其特征在于：具体步骤是：(1)VBNC细菌观察样本的前处理；(2)微孔滤膜疏水性检查与处理；(3)微孔滤膜染色；(4)VBNC细菌样本荧光染色；(5)VBNC细菌荧光标本的制备；(6)VBNC细菌荧光显微镜计数。其简化了操作流程，克服了现有技术的适用范围狭窄、取材困难、观察结果不准确等缺点，解决了细菌VBNC研究领域中的技术难题，提高从业者的实践操作水平。

主权项

1、细菌活的非可培养状态荧光显微镜观察与计数方法，其特征在于：具体步骤是：(1)、VBNC细菌观察样本的前处理VBNC细菌诱导前的菌液浓度为105-106个/mL，取可培养菌数为1×106个/mL的VBNC细菌液1mL至无菌离心管中，8000r/min离心2min，弃上清；然后用灭菌生理盐水充分洗涤菌体沉淀2次，每次均8000r/min，离心2min，弃上清；洗涤菌体时，应尽可能地除尽细菌培养液，以免培养液产生自发光而干扰观察结果；最后需将洗涤完毕的沉淀置于室温，用于立即观察；或者将菌体保存于4℃，在2天内备用；(2)、微孔滤膜疏水性检查与处理首先将直径25mm孔径0.2um的微孔滤膜完全浸入灭菌生理盐水中2min，再将微孔滤膜取出置于平皿中，光面朝上，仔细观察微孔滤膜表面，若微孔滤膜表面有部分面积没有水痕，则表示此滤膜疏水，应重新更换；或者将疏水滤膜浸入0.5％的吐温-80中，浸泡1min，而后将微孔滤膜转入可换膜针头式滤器内，在针管内注入灭菌生理盐水2mL，一并将吐温-80和盐水滤出；验证后的和吐温-80处理后的滤膜均光面朝上平铺于平皿内，37℃烘干，室温存放备用；(3)、微孔滤膜染色将上述处理完毕的微孔滤膜光面朝上平铺于平皿中，膜与膜之间不能重叠；而后用吸管吸取黑色钢笔墨水，在滤膜圆心处滴一滴，要让墨水从膜中心向四周自行浸染扩散，待墨水已全部浸透膜后，将平皿移至干热箱内，60℃烤膜20min，其间需用镊子轻轻夹起滤膜翻动2次，而后冷却，室温存放备用；(4)、VBNC细菌样本荧光染色将SYTO-9和PI染料配制成工作浓度，-20℃存放备用；将步聚1中的VBNC菌体沉淀溶于50μ1灭菌生理盐水中，贴壁加入工作浓度的SYTO-9和PI各25μ1至离心管中，瞬间离心，吹吸混匀，室温避光染色15min；(5)、VBNC细菌荧光标本的制备将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片中心处，吸取10μl染色完毕的VBNC菌液，滴在微孔滤膜圆心上，待菌液刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用手用力压片，除尽空气夹层；最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用OLYMPUS BX-51落射荧光显微镜于暗室中观察并计数；荧光显微镜的激发光波长480nm，发射光波长为610nm；待检标片可置于温盒内，在4℃低温存放1d；(6)、VBNC细菌荧光显微镜计数计数时至少随机选择10个不同视野，而每个视野中的细菌数不低于30-50个，而后取平均值；观察计数时，每个视野在1min之内完成；当看到呈现绿色荧光的即为活菌，而呈现红色荧光的即为死菌；VBNC细菌数的具体计数可参考以下公式：$E=\frac{X\times S_1}{S_2}\times \frac{1}{V}其中E为样品中细菌总数(个/mL)；X为各计数视野细菌总数的平均值(个)；S1为滤膜面积(mm)；S2为显微镜油镜的视野面积(mm)；V为待检VBNC细菌液的体积(mL)。$