[发明专利]一种烟叶在线醇化酶制剂及其制备方法

摘要

本发明是一种烟叶在线醇化酶制剂及其制备方法。主要解决烟叶在线工艺中在短时间内如何改善烟叶品质的技术问题。原料用新鲜烟叶或顶杈，经硫酸铵分级沉淀获得粗酶液后，用蔗糖低聚物完成酶活性保护，由此提高酶活性的稳定性和高效性，延长酶制剂的半衰期。酶制剂主要由氧化还原酶类组成，即葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱氧化酶五类酶，这些酶全部来源于新鲜烟叶或顶杈，其配比均是自然生成，不添加任何外源酶。该酶制剂在烟叶的在线处理过程中用清水稀释至施用，酶促反应在烟叶柜中2－4小时内完成。该技术利用生物酶的专一性和高效性，在短时间内促进烟叶内含物转化，达到烟叶在线处理过程中提高烟叶品质的目的，满足卷烟企业生产工艺的要求。

主权项

1、一种烟叶在线醇化的酶制剂的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：1)取鲜活烟叶或顶杈，破碎细胞，按体积比V缓冲液∶V汁液＝1∶9～10加缓冲液A：0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1M PMSF，于4℃，2600g离心20min；2)取上清液，缓慢加入(NH4)2SO4溶液至饱和，4℃缓慢混合30min，4℃15000g离心40min；3)取上清液，加入等体积(NH4)2SO4溶液，缓慢混合2小时或过夜，4℃15000g离心2h，收集沉淀，加缓冲液A：0.1M Tris-HCL，pH7.7，0.1M PMSF至沉淀充分溶解；4)溶解完全后，按1∶0.1～0.2体积比加入缓冲液B：0.1M Tris-HCl，pH7.7，0.1％EDTA(W/W)于4℃沉淀20min，8000g离心10min，获上清液，弃沉淀；5)上清液按1∶0.001～0.002体积比先后加入0.3％Ca(NO3)2·4H2O和0.2％MgSO4溶液，充分混匀，静置8-12小时或过夜；6)按1∶0.01～0.02体积比加入0.01％蔗糖低聚物溶液，静置1-1.5小时；溶液样品于-8℃干燥浓缩至原体积的1/8时停止，4℃解冻分装即获得烟叶在线醇化酶制剂原液。