[发明专利]一种晚香玉病毒的离体繁殖方法

摘要

本发明涉及一种晚香玉病毒的离体繁殖方法，属植物病毒繁殖技术领域，包括如下步骤：培养基的配制、毒源晚香玉的组织培养、病毒检测、毒源晚香玉病毒的离体繁殖。本发明的优点是：利用植物组织培养技术进行晚香玉病毒的离体繁殖，就可以无限制地繁殖下去，并保持了原有的侵染力；不仅解决了进境病毒病检疫中的毒源截获问题，还大大地简化了繁殖与保存毒源的步骤，省去以往为了保存某种毒源需要反复播种鉴别寄主、反复复活毒源及反复转接工作，以及播种前的土壤消毒工作，成倍地提高了工作效率，易提取制备高滴度病毒，为病毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒。

主权项

1、一种晚香玉病毒的离体繁殖方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：1)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：(1)基本培养基：诱导、增殖及生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～6.0；(2)诱导培养基：MS+BA 1.0～3.0mg/L和IAA 1.0～3.0mg/L；(3)增殖培养基：MS+BA 0.5～2.0mg/L和IAA 0.5～2.0mg/L；(4)生长培养基：MS+BA 0.1～1.0mg/L和IAA 0.1～1.0mg/L；(5)生根培养基：1/2MS+IBA 0.5～2mg/L和IAA 0.1～0.5mg/L；2)、毒源晚香玉的组织培养：(1)外植体的选取与灭菌：选取毒源鳞茎，剥除鳞茎外皮用自来水冲洗洗净，经灭菌处理后，在无菌条件下，切取幼芽或将鳞茎切成0.5cm×0.5cm×0.5cm见方的切块作为组培用外植体；(2)诱导培养：将幼芽或鳞茎切块接种在诱导培养基上，在培养条件下培养30～45天，从幼芽诱导成丛生芽或从鳞茎切块诱导形成幼芽；(3)增殖培养：将丛生芽或幼芽转接到增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出丛生芽；根据对幼芽数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行幼芽再增殖；(4)生长培养：将增殖的丛生芽转接到生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使丛生芽长高到3～5cm；(5)生根培养：将长大的丛生芽切成单株转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天，基部长出数根根系；(6)移栽：当生根组培苗长高至5～7cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质中，培育1～2个月后成苗；3)、病毒检测：(1)病毒提纯：取组培苗叶片或移栽成苗的叶片，低温保存，利用差速离心结合经二轮PEG沉淀的分离法，对组培苗叶片或移栽成苗的叶片的有关病毒进行分离、纯化，获得病毒制剂；(2)病毒制剂含量检测：利用免疫电镜捕获法及负染电镜法检测毒源晚香玉病毒含量、纯度；(3)病毒ELISA检测：将田间晚香玉发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对组培苗进行病毒ELISA检测，鉴定其病毒种类；(4)病毒的致病力测定：利用常规摩擦法，接种晚香玉测定毒源晚香玉体内病毒的致病力；4)、毒源晚香玉病毒的离体繁殖：将步骤2)增殖的组培苗经病毒检测后带有病毒的丛生芽，根据对毒源幼芽数量的需求，每隔30～45天按将步骤2)同样方法进行毒源幼芽再增殖。