[发明专利]中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法

摘要

本发明公开的中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法，利用Bac－to－Bac/BmNPV杆状病毒表达系统构建得到重组Bacmid－MRJP1并转染家蚕细胞，获得重组病毒后注射家蚕幼虫，感染96h后收集血淋巴，经亲和柱纯化后获得了高纯度重组MRJP1，将纯化后中华蜜蜂MRJP1真核表达产物经胰蛋白酶酶切，超滤膜离心过滤，用CaCl₂去除磷酸盐，得到抗高血压多肽混合物。本发明方法制得的多肽具有降血压功能。

主权项

1.中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法，其特征步骤如下：1)MRJP1基因的克隆a)以中华蜜蜂8日龄工蜂头部MRJP1 cDNA为模板，采用Primer Primier 5.0软件，设计上游引物F-Prime序列为5’-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列为3’TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5’，分别在上游引物F-Prime序列与下游引物R-Prime序列中引入酶切位点Nco I和Not I；b)PCR反应体系共50μl，组成如下：5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl2、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中华蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/l Taq DNA Polymerase，加ddH2O至终体积为50μl；PCR反应条件如下：PCR反应体系先在94℃预热3min，然后94℃变性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物电泳分析后经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，克隆至TaKaRa公司的pMD18-T载体，经PCR和双酶切鉴定，并测定其序列；2)重组Bacmid病毒的构建a)将鉴定正确的pMD18-T-MRJP1质粒经Nco I和Not I酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pFastBacHTb表达载体在16℃的条件下连接过夜，将连接产物转化入TG1感受态细胞，得到转移载体pFastBacHTb-MRJP1，经PCR和双酶切鉴定正确后转化入DH10Bac感受态细胞；b)将上述DH10Bac感受态细胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素及7μg/ml庆大霉素的LB平板，挑取白色菌落，以M13通用引物进行PCR检测，获得含有中华蜜蜂MRJP1重组Bacmid病毒；c)PCR检测反应条件如下：先94℃预热3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35个循环，最后72℃延伸7min；3)家蚕细胞的培养与转染a)家蚕细胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养；然后接种于50ml培养瓶中，培养至2×106/瓶，离心去除血清，备用；b)将194μl无血清培养基与6μl FUGENE 6转染剂混匀，室温静置5min，再加入4μg重组Bacmid DNA，混匀，室温静置45min；将该混合液逐滴加入细胞培养瓶中，边加边摇，27℃温育7h后，弃共转染液，加入6ml含血清的完全培养基继续培养3-5天，取上清液，10000rpm，离心2min，上清液于4℃避光保存备用；将所获病毒上清液继续感染细胞，扩繁病毒，收集第三轮感染的病毒上清液，用于注射家蚕幼虫；4)中华蜜蜂MRJP1在家蚕幼虫中的表达及纯化将重组病毒及对照物ddH2O通过皮下注射导入家蚕五龄第一天幼虫，5μl/头，感染96h后收集其血淋巴，经超声波破碎，8000rpm，5min，4℃离心后，取上清液，用Ni-NTA亲和柱纯化，获得中华蜜蜂MRJP1真核表达产物。5)中华蜜蜂MRJP1真核表达产物酶解制备抗高血压多肽将纯化后中华蜜蜂MRJP1真核表达产物与胰蛋白酶于37℃共同孵育6h，100℃煮沸5min，使胰蛋白酶失活，经超滤膜离心过滤，得到分子量在10kDa以下的小肽混合物，用CaCl2去除磷酸盐，得到抗高血压多肽混合物。