[发明专利]一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法

摘要

一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前酿酒酵母缺乏木糖醇脱氢酶(XDH)，而不能使木糖代谢后产生乙醇问题。构建方法：一、克隆xyl2基因；二、回收、纯化xyl2基因片段后与pGMT vector载体连接，得到pGMT－xyl2；三、重组质粒p406ADH1－1的构建；四、重组质粒p406ADH1－2的构建；五、重组质粒p406ADH1－3的构建；六、将xyl2基因加入质粒p406ADH1－3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒。本发明方法所构建的载体转化酿酒酵母后实现了木糖醇脱氢酶基因的高效稳定表达。

主权项

1、一种表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木糖醇脱氢酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、以休哈塔假丝酵母基因组为模板克隆xyl2基因；二、回收、纯化xyl2基因片段后与pGMT vector载体在16℃的条件下连接10～12h，得到pGMT-xyl2；三、重组质粒p406ADH1-1的构建，克隆质粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入ADHt基因；四、重组质粒p406ADH1-2的构建，克隆质粒pKT0150中的KanR基因，再将KanR基因加入质粒p406ADH1-1；五、重组质粒p406ADH1-3的构建，克隆酿酒酵母中的rDNA基因，再将rDNA基因加入质粒p406ADH1-2；六、将xyl2基因加入质粒p406ADH1-3，即得到表达木糖醇脱氢酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序列为5’-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3’，下游引物序列为5’-TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3’；步骤三中ADHt基因序列扩增上游引物序列为5’-AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列为5’-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步骤四中KanR基因扩增上游引物序列为5’-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3’，下游引物序列为5’-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3’；步骤五中rDNA基因扩增上游引物序列为5’-CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3’，下游引物序列为5’-TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。