[发明专利]一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：(1)PCR模板DNA提取：(1.1)待测样品DNA提取：取1ml待测样品进行DNA提取，1ml待测样品-12000rpm，2min，弃上清-沉淀用PBS洗两次-200μl TE重悬-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min-按照UNIQ-10DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K，55℃水浴30min-后参照UNIQ-10DNA提取试剂盒说明书提取DNA；(1.2)菌液DNA提取；(2)hly与ipaH质粒标准品的构建：(3)荧光定量PCR扩增及分析。本发明的有益效果：本发明运用双重荧光定量PCR(TaqMan探针)同步定量检测单增李斯特菌hly基因和志贺氏菌ipaH基因，为食品卫生行业提供一种特异、快速、定量准确的同步定量检测单增李斯特菌和志贺氏菌的方法。

主权项

1、一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1. 1)、PCR模板DNA提取：(1. 1.1)、待测样品DNA提取：取1ml待测样品进行DNA提取，取其中4个稀释度的0.1ml菌液涂布BHI平板，于37℃培养24h，进行菌落记数；1ml待测样品-12000rpm，2min，弃上清-沉淀用PBS洗两次-200μl TE重悬-加入8μl溶菌酶(10mg/ml)及2μl RNaseA(10mg/ml)，37℃水浴30min-按照UNIQ-10 DNA提取试剂盒加入裂解液与蛋白酶K，55℃水浴30min-后参照UNIQ-10 DNA提取试剂盒说明书提取DNA；(1. 1.2)、菌液DNA提取：取过夜培养的菌液，采用UNIQ-10DNA提取试剂盒提取；(1. 2)、hly与ipaH质粒标准品的构建：(1. 3)、荧光定量PCR扩增及分析：将已经计算出原始拷贝数的单增李斯特菌与志贺氏菌质粒DNA，按10倍梯度稀释，取数量级105copies/μl到101copies/μl作为模板加入25μl反应体系，在IQTM5荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，得到标准曲线；其中PCR扩增反应体系(25μl)：模板DNA各1μl；2×Premix ExTaqTM12.5μl；10μmol/L引物各1μl；10μmol/L探针各0.5μl；加灭菌超纯水至25μl，反应条件：95℃ 3min；95℃ 15s；58.5℃ 1min，45个循环。