[发明专利]一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法

摘要

一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法，属于免疫检测方法技术领域。本发明用于标记抗体的量子点为QD650，将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入双氟米松标准溶液或待测样品形成抗原－抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原－抗体发光免疫复合物的荧光强度，通过与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度。本发明不需加显色物质就能检测待测样品中双氟米松的含量，即通过抗原－抗体免疫复合物的荧光强度，间接检测待测样品中双氟米松的浓度值，无论操作还是反应均只需一步就可完成；本方法用于标记抗体的量子点与传统荧光相比，发射的荧光强度更强，且荧光稳定时间长。

主权项

1.一种量子点标记的间接竞争荧光免疫检测双氟米松的方法，其特征在于：将包被原直接包被在酶标板的微孔中，加入双氟米松标准溶液或待测样品形成抗原-抗体发光免疫复合体，用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，通过与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度；(一)用变性牛血清蛋白dBSA包裹发绿光的QD650标记抗双氟米松多克隆抗体(1)BSA变性：将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4，室温下反应1h，60-80℃下加热20min，分解过量的NaBH4，BSA变性，二硫键打开成-SH，控制最终的dBSA水溶液的浓度为5×10-5M；(2)变性BSA包裹量子点dBSA-QDs：将dBSA和量子点按摩尔比1∶1～1∶6混合，60-80℃水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全；(3)变性BSA包裹量子点偶联抗体将5μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC 0.056M与5μL硫代N-羟基琥珀酰亚胺sulfo-NHS 0.1M混合10s后，加入至25μL dBSA-QDs 2×10-5M中，变性BSA包裹的量子点活化15min，加入9.6μL抗体Ab 5×10-5M，反应中，反应物摩尔比控制为：dBSA-QDs∶Ab＝1∶1，dBSA-QDs∶EDC∶NHS＝1∶560∶1000，室温下反应4h，得到量子点标记的双氟米松抗体，反应液中抗体的浓度为1.03mg/mL，用0.1％明胶的含吐温的pH7.4、0.01M磷酸盐缓冲液作抗体稀释液稀释1000倍待用；(二)抗原的包被用双氟米松与卵血清白蛋白偶连体作为包被原，用pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将双氟米松包被原稀释至1-20μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱过夜，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，按200μL/孔加0.1％明胶进行封闭；(三)抗原-抗体二元发光免疫复合体的形成在封闭后的酶标板孔中加入双氟米松标准溶液或待测样品50μL，稀释的量子点标记的双氟米松抗体50μL，37℃孵育1h，抗原与双氟米松药物竞争抗体，部分抗体与抗原形成抗原-抗体二元免疫复合物，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸盐缓冲液洗三次，去掉非特异性吸附；(四)定量荧光检测用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体发光免疫复合物的荧光强度，激发波长：430nm；发射波长：650nm，通过与标准溶液对比求出待测样品中双氟米松的浓度。