[发明专利]从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法

摘要

本发明涉及一种蛋白酶的提取纯化工艺，具体是从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法。所说的从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法是先从动物心肌中获得粗提液，再经盐析后，选用DEAE－Fast Flow、CM－Sephadex FF离子交换层析及蓝色琼脂糖凝胶FF三种层析介质，采用色谱法从猪心中分离和纯化高铁肌红蛋白还原酶。本发明方法具有产品纯度高，工艺简单、成本低等优点，既可填补我国该生物试剂制备的空白，又具有较高的经济价值。

主权项

1、一种从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法，包括以下步骤：1)将新鲜动物心肌剁碎，加水匀浆处理，粗匀浆用2N NH4OH把pH调至7.5，静置离心、过滤后得粗提液；2)粗提液经40％-70％硫酸铵盐析，得到的沉淀用平衡缓冲液重悬，离心后取上清液对平衡缓冲液透析，透析膜的截留分子量为14 000，得透析液；所说的平衡缓冲液是0.02M磷酸缓冲液，pH6.0；3)将透析液上样到用缓冲液A平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用缓冲液A冼脱杂蛋白，再用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集合并酶活性部分，浓缩透析；所说的缓冲液A是0.002M、pH7.0、含0.001M EDTA的磷酸盐缓冲液；缓冲液BJ是0.2M、pH7.0、含0.001M EDTA磷酸盐缓冲液；4)将得到的透析液上样到用缓冲液C平衡过夜的CM-Sephadex Fast Flow阳离子交换层析柱；用缓冲液C洗脱杂蛋白，洗脱完后，用缓冲液D洗脱，收集合并酶活性部分，透析浓缩；所说的缓冲液C是0.02M、pH6.0磷酸缓冲液，所说的缓冲液D是0.2M、pH6.0磷酸缓冲液；5)将具有酶活组分的洗脱液冷冻干燥后，上样到用缓冲液E平衡的蓝色琼脂糖凝胶FF亲和层析，用缓冲液E洗脱杂蛋白，最后用缓冲液E和含1.0M NaCl的缓冲液E组成的线性梯度洗脱，收集具有酶活组分的洗脱液，即得到纯化的高铁肌红蛋白还原酶；所说的缓冲液E是0.03M、pH6.0、含0.001M EDTA磷酸盐缓冲液。