[发明专利]一种AMACR自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用

摘要

一种AMACR自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用，涉及体外免疫检测领域。本发明提供一种AMACR自身抗体ELISA检测方法，用特异性抗原AMACR包被微孔反应板，加待测血清到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照；加酶标二抗，显色和终止反应并读数；酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。所述AMACR自身抗体的检测方法的应用，在前列腺癌诊断中，检测人血液中AMACR自身抗体，作为诊断前列腺癌的标志物。本发明优点在于相对于目前国内市场上利用检测人血液中PSA的浓度来诊断前列腺癌的方法，在灵敏度和特异性上都有很大的提高。

主权项

1、一种α-甲基酰基辅酶A消旋酶AMACR自身抗体的检测方法，其特征是：A、试剂的配制：(1)0.05M、pH9.6包被缓冲液：1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3，加超纯水定容至1000mL；(2)0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS：8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；(3)0.15M，pH7.4磷酸盐-吐温缓冲液PBST：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4和0.5mL Tween-20，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；(4)封闭液：1.0g明胶溶于100mL 0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS中；(5)0.05M、pH 5.6底物缓冲液：39.8g Na2HPO4·12H2O、6.3g柠檬酸，加超纯水定容至1000mL；(6)显色液：10mL pH5.6底物缓冲液、10mg四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜配制的1％四甲基联苯胺0.1mL和32μL 0.75％H2O2混合均匀，现用现配；(7)终止液：2M H2SO4；(8)阳性对照血清：取筛出的阳性血清OD450≥0.500，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；(9)阴性对照血清：取正常男性血清OD450≤0.100，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；所述的试剂的配制按照实际需要按比例来配制；B、AMACR自身抗体ELISA检测方法(1)包被：用包被缓冲液将特异性抗原AMACR稀释至0.1～10μg/mL，在微孔反应板中每孔加入50μL，37℃水浴中反应2h或4℃冰箱过夜，倒净，以洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；(2)封闭：微孔反应板中每孔加入150μL封闭液，37℃反应1.5小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；(3)加待测血清：用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将待测血清稀释10～500倍后以每孔50μL加到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；所述的加待测血清过程中，空白对照、阴性对照、阳性对照分别为应加的稀释后的待测血清作如下替代：空白对照为：只加50μL PBST稀释液；阴性对照为：加相同于待测血清稀释倍数的阴性对照血清50μL；阳性对照为：加相同于待测血清稀释倍数的阳性对照血清50μL；其余操作均与待测血清的操作相同；(4)加酶标二抗：用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将商品化的HRP-鼠抗人IgG稀释至工作浓度，根据购买HRP-鼠抗人IgG时所附的说明书来稀释，微孔反应板中每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；(5)显色：微量反应板每孔加50μL的显色液，37℃显色反应10～15分钟；(6)终止反应并读数：微量反应板每孔加2M的硫酸25μL终止显色反应，酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。