[发明专利]一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法

摘要

一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，它涉及一种真菌菌群结构的分析方法。它解决了目前黄檗丛枝菌根真菌菌群结构分析方法分析结果波动大、准确性差的问题。分析步骤：一、提取DNA；二、Nested－PCR；三、变性梯度凝胶电泳；四、采用DNA测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构。本发明方法针丛枝菌根真菌遗传保守区18S rDNA NS31/Glo1进行检测分析，经过三次PCR扩增黄檗丛枝菌根真菌DNA的拷贝数高，可以获得大量的目标产物丛枝菌真菌18S rDNA NS31/Glo1区片段，便于步骤三进行变性梯度凝胶电泳；因此本发明方法具有准确性高，重复性好，稳定性高的优点。

主权项

1、一种黄檗丛枝菌根真菌菌群结构的分析方法，其特征在于黄檗丛枝菌根真菌菌群结构按以下步骤进行分析：一、黄檗丛枝菌根和黄檗根际土壤丛枝菌根真菌总DNA提取；二、Nested-PCR扩增真菌18SrDNA NS31/Glo1区：进行三次PCR扩增；三、用步骤二第三次PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳：采用变性聚丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围30％～60％、电泳电压130V、电泳时间8h、电泳温度为60℃；四、采用DNA测序技术，即可分析出黄檗丛枝菌根真菌的菌群结构；其中步骤二中第一次PCR扩增的引物为GeoA2：5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′和Geo11；5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′；第一次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL菌群总DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第一次PCR扩增反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸7min；步骤二中第二次PCR扩增以稀释100倍的第一次PCR扩增产物作为模板DNA ，第二次PCR 扩增引物为NS31-GC：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和AM1：5′-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3′；第二次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第二次PCR扩增反应条件：94℃预变性2min，94℃变性45s、65℃退火1min、72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸7min；步骤二中第三次PCR扩增以稀释100倍的第二次PCR扩增产物作为模板DNA，第三次PCR扩增引物为NS31-GC：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3′和Glol：5′-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3′；第三次PCR扩增体系为20μL由2μL含Mg2+10×PCR buffer、1.6μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、2μL浓度为1.0μmol/L的Geo11、2μL浓度为1.0μmol/L GeoA2、1U的Taq DNA聚合酶、2μL模板DNA和余量的无菌双蒸馏水组成；第三次PCR扩增反应条件：94℃预变性2min，94℃变性45s、55℃退火1min、72℃延伸45s，30个循环，最后72℃延伸7min；步骤三中的聚丙烯酰胺凝胶按质量百分比基本上由8％的丙烯酰胺制成。