[发明专利]一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法

摘要

本发明公开了一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，是通过构建环境诱导型表达质粒表达PHB合成酶基因phbCAB，在不添加任何诱导剂的条件下，phbCAB基因通过环境胁迫等外界条件的诱导而表达，从而催化聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成。发酵结果表明，在不添加任何人工诱导剂的条件下，重组大肠杆菌DH5α/pEPI－phbCAB PHB含量高达到细胞干重的85.7％。本发明中重组大肠杆菌DH5α/pEPI－phbCAB具有重要的应用前景和价值。

主权项

1.一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其步骤包括：(1)一种环境诱导型表达质粒的构建；(2)聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建；(3)获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；(4)发酵重组大肠杆菌生产聚羟基脂肪酸酯并检测；其特征是：步骤(1)所述环境诱导型表达质粒的构建方法是以大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue基因组为模板，通过设计引物PCR体外扩增环境诱导片段并将其命名为EPI；将EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，取代原来的启动子序列，获得重组环境诱导型表达质粒；步骤(2)所述聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建的方法是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes.latus)、自养黄杆菌(Xanthobacterautotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas.putida)的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phbCAB克隆至环境诱导型表达质粒中，获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒；步骤(3)所述获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌的方法是将聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒转化大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue，获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；步骤(4)所述发酵重组大肠杆菌的发酵条件为：温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间36h～72h；发酵培养基组成为Na2HPO4 6g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1g/L、酵母浸出物 2g/L～4g/L、MgSO4 2mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、葡萄糖 10g/L～30g/L。