[发明专利]一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法

摘要

本发明公开了一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的细菌细胞密度，该方法可使水体样品分析从取样到出报告的时间缩短到几个小时，测定结果稳定，重现性好。本发明测定结果的标准偏差均低于MF检测结果，检测结果稳定，检测的重现性有了大幅度提高。

主权项

1.一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，其特征在于，该方法运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的细菌细胞密度，具体包括下列步骤：步骤一，设计并合成肠道病原细菌PCR通用引物：该肠道病原细菌的PCR通用引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：上游引物：5’-aaggcgacgatccctagctggtctgagaggatga/c-3’，下游引物：5’-gcttgccagtatcagatgcagttcccaggttgagc-3’；步骤二，制作定量PCR标准曲线：标准曲线的纵坐标是已知细胞浓度的埃希氏大肠杆菌梯度稀释DNA提取物QPCR检测的CT值，横坐标是相应的埃希氏大肠杆菌细胞密度；步骤三，细菌浓缩回收及细菌DNA提取：地表水水样通过离心收集细菌细胞，细菌DNA的提取采用细菌裂解缓冲液及苯酚-氯仿法提取；步骤四，定量PCR反应体系及相关参数的确定：QPCR扩增反应体系总体积25μL，内含1×realMastrMix/1×SYBRsolution，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl2，上下游引物分别为0.1mmol/L，DNA模板2μL；PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃链延伸5min。阴性对照中，用灭菌双蒸水代替DNA模板，每隔0.2s自动读数一次，阈值设定为最初的3～7个循环荧光值标准偏差的10倍；步骤五，结果计算：通过已知细胞数量的埃希氏大肠杆菌QPCR标准曲线，即可确定环境水样中目标细菌细胞的数量。