[发明专利]一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法

摘要

本发明公开了一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和雷公藤生物碱的方法，该方法以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为原始材料，对外植体进行愈伤组织诱导、继代培养，建立悬浮细胞系，建立并筛选出了适合通过二步细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的细胞悬浮体系及其相应的生长培养基和生产雷公藤甲素培养基以及雷公藤生物碱培养基配方。利用该方法生产雷公藤甲素和雷公藤总生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

主权项

1.一种由雷公藤细胞培养法生产雷公藤甲素和生物碱的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70％质量分数的酒精消毒20s，然后以无菌水冲洗4次，再用1g/L HgCl2消毒4min，无菌水冲洗4次；步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：MS+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT，pH值为5.8，并在培养基中加入蔗糖30g/L，培养室温度为25±1℃，保持每天12小时的光照，光照强度为1000lx～1500lx，20～30天后形成愈伤组织；步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40～45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为：6，7-V+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT；步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为8g/L～12g/L，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为NT+(0.5～1.0)mg/L 2，4-D+(0.1～0.5)mg/L KT，选择250mL三角瓶，装培养基100mL，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度25±1℃，自然光照，摇床转速120转/分钟，每25～30天继代培养一次，连续继代培养5次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系，作为供试种子；步骤五，在超净工作台中将供试种子接种于生长培养基中进行培养扩增，接种量为8g/L～12g/L，接种后的培养瓶放入培养室中的摇床上，培养条件为：温度25±1℃，无光照，摇床转速120转/分钟，培养30天后，将其分别转至生产雷公藤甲素培养基和雷公藤生物碱培养基中；培养条件为：温度25±1℃，自然光照，培养20天后，收获悬浮培养细胞及培养液；步骤六，将悬浮培养细胞及培养液过滤，冷冻干燥，培养液自然风干至1/3；步骤七，采用常规的方法对悬浮培养细胞和风干的培养液进行萃取，即可得到雷公藤甲素和雷公藤总生物碱。