[发明专利]利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒的方法

摘要

本发明涉及“超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的方法”，属于生物工程领域。在病毒脱除过程中，预培养蔗糖浓度为0.5mol/L，处理3d；装载处理为25℃，60min；玻璃化处理为0℃，120min；液氮处理60min后，进行40℃水浴2min，草莓茎尖的存活率为76％，草莓轻型黄边病毒的脱毒率达到95％。只有通过液氮处理才可以脱除该病毒，液氮处理前的玻璃化处理脱毒率为0％。与茎尖培养脱毒法和热处理脱毒法等传统的脱毒法相比，超低温脱毒法不仅脱毒率很高，而且简单易行，便于操作，更不需要昂贵的仪器。从而为草莓无毒苗的示范推广及其产业化提供强有力的技术支持。

主权项

1、利用超低温技术脱除草莓轻型黄边病毒SMYEV的方法，其基本特征在于：1)以草莓栽培品种‘明宝’为材料，参考王国平《中国果树病毒病原色图谱》，金盾出版社，2000，描述的草莓轻型黄边病症状，在田间寻找叶片边缘失绿，植株矮缩，叶片黄化、卷曲的草莓植株，对所取的植株进行总RNA提取，反转录为cDNA，根据的登录号D12517的SMYEV的外壳蛋白序列和登录号AJ316582的ndhB基因序列，参考Thompson等的研究设计引物，ndhB的引物为：P1：5＇-GGACTCCTGACGTATACGAAGGATC-3＇P2：5＇-AAACAACGCTTGTAAGGAGTCC-3＇SMYEV的引物为：Y1：5＇-GTGTGCTCAATCCAGCCAG-3＇Y2：5＇-CATGGCACTCATTGGAGCTGGG-3＇利用结合内标的多重RT-PCR进行SMYEV的检测，20μL的多重RT-PCR反应体系包含4μL 10×PCRBuffer，1.5mmol·L-1MgCl2，0.2mmol·L-1dNTP，引物P1、P2、Y1、Y2的浓度均为0.1mmol·L-1，0.5UrTaq酶；反应程序为94℃，2min；94℃，30s；57℃，40s；66℃，2min；35个循环，72℃延伸5min；最后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增到了大约270bp的目的片段，目的片段回收按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行，回收片段与PMD19-T载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行培养，PCR鉴定阳性克隆，测序，登录NCBI，用BLAST分析软件，与GenBank登录号为AJ577337的SMYEV分离物CH1和登录号为AY955375的sy01序列进行比对，同源性均为98％，证明为SMYEV的特异片段，同时还扩增到了大约570bp的ndhB基因的目的片段；2)将含有SMYEV的植株拨取茎尖，经消毒杀菌后接到初代培养基上，初代培养基为：MS加入0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、0.088mol/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，pH＝5.8，每四周继代一次，取继代5次的组培苗，取约2mm左右的茎尖，接种于MS加入0.5mol/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉、pH＝5.8的培养基上预培养3天，培养条件：25℃，暗培养；取预培养过的茎尖，放入装载溶液中，装载液为MS加入2mol/L甘油和0.75mol/L蔗糖，pH＝5.8，处理温度为25℃，处理时间为60min；装载过程中，发现茎尖随着时间的延长，慢慢的沉到液体底部，将装载过的茎尖转移到PVS-2溶液中，PVS-2溶液为：MS加入质量体积比30％甘油、质量体积比15％聚乙二醇、质量体积比15％二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖，pH＝5.8，处理温度为0℃，处理时间为120min；然后转入10ml冻存管中，直接投入液氮中处理60min，冰冻速率为200℃/min，从液氮中取出冻存管，快速转移到40℃、解冻速率为200℃/min的水浴锅中，处理2min；然后取出茎尖放入MS加入1.2mol/L的蔗糖溶液中约20min，直到茎尖漂浮在液体表面，将处理过的茎尖转入增殖培养基中，暗培养1周后进行光照培养，一个月后统计存活率，并将再生株系转移到增殖培养基上进行扩繁，增殖培养基同初代培养基；3)利用结合内标的多重RT-PCR技术进行草莓再生株系的SMYEV检测，具体方法如步骤1)所述，获得脱除草莓轻型黄边病毒SMYEV的株系。