[发明专利]极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法

摘要

本发明公开了极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法，依以下步骤进行：尼龙膜121℃灭菌15min；E.coli JM109BL21(DE3) pET－20b－Cel12B在5mL的LB液体培养基中培养6小时；4μl浓度5μg/mLIPTG涂在LB固体培养基上，37℃正放2－3小时；菌液涂LB固体平板上，37℃培养15小时；平板4℃放置1－2小时；尼龙膜置于平板上影印菌落；尼龙膜影响菌落面向上置于LB固体平板上，37℃倒置培养4－5小时；尼龙膜置于经细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液浸泡上30min；尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，70℃放置3小时；在揭去尼龙膜筛选平板上0.1％的刚果红显色15min，1mol/L NaCl脱色15min，挑取透明圈菌株。本发明方法简单，省时省事，筛选效率高，筛选效果好。

主权项

1.极耐热葡聚糖酶重组菌固相平板筛选方法，其特征在于筛选方法依以下步骤进行：(1)将直径9cm的尼龙膜夹在两层滤纸中间进行常规121℃灭菌，15min；(2)极耐热葡聚糖酶重组菌为E.coli JM109BL21(DE3)pET-20b—Cel12B，用接种环挑取一环重组菌在5mL的LB液体培养基中振摇培养6小时；其中，LB液体培养基配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10.0g，调节pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55℃加入氨苄青霉素100mg；其中，LB液体培养基中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL；(3)将4μminl.gif的浓度5μg/mL的IPTG均匀地涂在直径9cm培养皿的LB固体培养基上，37℃正放2—3小时；其中，LB固体培养基配制：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10.0g，琼脂15g，调pH至7.2，用蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，冷却至55℃加入氨苄青霉素100mg，摇匀后倒平板；其中，LB固体培养基中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL；(4)将第二步获得的菌液均匀地涂在第三步已涂有IPTG的LB固体平板上，37℃培养15小时，使每个平板长出50个左右的菌落；(5)第四步培养好的平板4℃放置1—2小时；(6)菌落的原位膜转印：取第一步中尼龙膜置于第五步的平板上影印菌落；37℃继续培养被影印后平板3小时，该平板称为原平板；(7)将第六步菌落转印的尼龙膜的菌落面向上，置于另一块新的含有氨苄青霉素100μg/mL的LB固体平板上，37℃倒置培养4—5小时；(8)用细胞壁裂解液、细胞膜裂解液和平衡缓冲液分别浸泡三张滤纸，取出后放在干净的培养皿内，用玻棒赶去多余液体以防止尼龙膜所附菌落被冲散，将第七步尼龙膜菌落面向上按顺序置于三张滤纸上30min；其中，1升细胞壁裂解液含25mmol Tris-HCl(pH8.0)、1g溶菌酶和1mmol EDTA(pH8.0)；其中，1升细胞膜裂解液含10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1g(wt/vol)Triton-x-100；其中，1升平衡缓冲液含50mmol Tris-HCl(pH8.0)；(9)将第八步尼龙膜菌落面向下铺于筛选平板上，70℃放置3小时；其中，筛选平板制备：将琼脂粉20g、羧甲基纤维素钠5g和0.1mol/L咪唑-邻苯二甲酸氢甲缓冲液1L混匀，高压灭菌，冷却后倒平板；(10)揭去第九步筛选平板上尼龙膜，在筛选平板上倒上0.1％的刚果红，显色15min，弃去刚果红，倒上1mol/L NaCl脱色15min，确定产透明圈的菌落，挑取相应菌株，即为极耐热葡聚酶重组菌的候选。