[发明专利]一种低氮排放的工程菌发酵制取有机磷水解酶的方法

摘要

本发明涉及一种工程菌发酵表达方法。目的是提供一种工程菌发酵制取有机磷水解酶方法的改进，该方法应在保持发酵水平的同时，具有污染排放少、污染处理负荷低的特点，并且工艺简单、操作方便。技术方案是：一种低氮排放的工程菌发酵制取有机磷水解酶的方法，依次按以下步骤进行：1)选择菌种，2)培养斜面菌种，3)培养一级菌种，4)发酵罐内培养二级菌种，5)发酵罐内发酵，6)酶粉提取。

主权项

1、一种低氮排放的工程菌发酵制取有机磷水解酶的方法，依次按以下步骤进行：1)菌种选择选用名为(E. coli BL-21(DE3)携带质粒pETDuet-opd-b1)的工程菌作为制取有机磷水解酶的菌种；2)培养斜面菌种斜面培养基中的成分及重量比：葡萄糖0.1％，酵母浸出粉1％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.12％，磷酸二氢钾0.04％，氯化镁0.1％，氯化钠0.3％，琼脂粉1.5-2.0％，其余为蒸馏水；调节PH至7.1后进行灭菌，灭菌条件为2kg/cm2蒸汽20～30分钟，灭菌后使培养基保持无菌环境；接种量为1接种环接2个9厘米标准培养皿或3支试管斜面；斜面培养时间为18～36小时；3)培养一级菌种培养基中含有：蛋白胨10g，酵母浸出粉3g，硫酸铵10g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾1.2克，磷酸二氢钾0.4克，氯化镁1克，氯化钠5g，复合溶液1mL；加蒸馏水定容至1000ml后，调节PH至6.8；取100～400毫升培养基置于三角瓶中，用纱布封口后灭菌，灭菌条件为2kg/cm2蒸汽10～30分钟；灭菌后保持无菌状态；接种量：每支斜面菌种接入3个三角瓶；培养：旋转式摇床100～210转/分，培养温度：34℃～36℃，培养时间17～30小时；培养结束后显微镜镜检，菌体应大小一致，无杂菌感染，OD600净生长值应大于2.0；4)发酵罐内培养二级菌种培养基中的成分及重量比：蛋白胨0.3％，酵母浸出粉0.1％，硫酸铵2.0％，葡萄糖2.0％，磷酸氢二钾0.17％，磷酸二氢钾0.06％，氯化钠0.3％，其余为蒸馏水；每升培养基中加复合溶液1毫升，调节PH至7.0；装量后灭菌，装量为种子罐有效容积的60％，灭菌条件是115℃蒸汽10～30分钟；灭菌后保持无菌状态；一级菌种的接种量为培养基重量的5％；培养温度34℃～36℃，培养时间15～30小时；罐压1kg/cm2；搅拌转速100～400转/分；保持罐内相对溶氧大于50％；通风量为体积比1∶0.5～1.5；培养结束后，显微镜镜检，菌体应大小一致，无杂菌感染，OD净生长值应大于2.0；5)发酵罐内发酵培养基中的成分及重量比：酵母浸出粉0.05％—0.1％，硫酸铵0.5％-1.0％，氯化铵0.5％-1.0％，葡萄糖0.3％-1.0％，氯化钠0.1％-0.3％，磷酸氢二钾0.1％-0.17％，磷酸二氢钾0.03％-0.06％，其余为蒸馏水；每立方米培养基加一升复合溶液，调节PH至7.0；装罐后灭菌，装罐量为发酵罐有效容积的70％，灭菌条件为115℃蒸汽10～30分钟；二级菌种的接种量为培养基重量的1～10％；发酵时搅拌并通风，起始风量：体积比为1∶0.5～1.5；并保持相对溶氧大于50％直至相对溶氧不再增加时，将发酵液泵入冷冻贮罐内，迅速降温到4℃，结束发酵；6)酶粉提取(1)向发酵液中加入0.01％～0.05％的聚乙烯醇，充分搅拌，16000rpm离心分离菌体，清液处理后排放；(2)将湿菌体与1～5％的海藻糖溶液按体积比1∶1～50混合；(3)将上述混合液经破碎机破壁二次，或用超声波破碎机破壁；(4)将得到的破壁菌液冷冻干燥，冻结温度—45℃，蒸发温度小于45℃；(5)将干燥物料经过锤式粉碎机粉碎，过100目筛，即可得到粗酶粉。