[发明专利]离体快速繁殖地乌的方法

摘要

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种离体快速繁殖地乌的方法。该方法包括地乌外植体的选择与消毒，不定芽的诱导与增殖，拟球茎诱导与增殖、胚性愈伤组织的诱导、增殖、分化及生根等完整步骤。本发明提出了地乌外植体无菌消毒培养体系、培养程序及专用培养基等多项关键技术，成功地培育出地乌试管苗。本发明克服了自然条件下地乌繁殖周期长、繁殖系数低等缺点，为工厂化快速繁殖地乌试管苗提供了实用技术。

主权项

1、一种离体快速繁殖地乌的方法，其特征在于以下步骤：(1)外植体的选择与消毒：1)选择地乌根茎带老组织的长度为1-2cm的休眠芽和刚萌发未展开的叶片作外植体；2)将该外植体用如下方法进行消毒：a. 外植体为休眠芽的消毒：先在自来水下将地乌根茎芽体表面的泥沙冲洗干净，并用软毛刷将乌根茎芽体表面的老死组织刷洗干净，至芽体呈现白色，用1.5％的多菌灵水溶液浸泡2h，在用自来水冲洗0.5h，转移至超净工作台，用75％酒精消毒30-60s，无菌水冲洗1-2遍，再用0.2％升汞溶液消毒8-12min，无菌水冲洗4-5遍，使该外植体在每次无菌水中的冲洗时间至少保持为1min，备用；b. 外植体为刚萌发未展开的叶片的消毒：将刚萌发未展开的叶片用自来水冲洗干净，转移至超净工作台上，用75％酒精消毒30s，0.2％升汞消毒5min，无菌水冲洗2-3遍，备用；(2)接种与培养：用无菌滤纸吸去所述外植体表面水分，将所述叶片切成1cm×1cm小块；或将休眠芽表面的老组织切除，然后从该芽中间剖开；将所述的休眠芽或叶片的外植体接种到不定芽或拟球茎诱诱导培养基上，诱导产生不定芽或拟球茎；或者将所述的芽或刚萌发未展开的叶片外植体接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，使其诱导产生胚性愈伤组织；外植体培养条件为：每天光照12h，培养温度17-20℃，光照强度3000Lux，得到地乌不定芽或拟球茎或胚性愈伤组织；(3)继代、增殖与分化培养：将步骤(2)得到的拟球茎或不定芽转移到不定芽或拟球茎增殖培养基上进行增殖培养；或将步骤(2)得到的胚性愈伤组织转移到胚性愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养，进而再转移到分化培养基上培养，得到丛生芽；继代、增殖和分化的条件：每天光照12h，培养温度17-20℃，光照强度为3000Lux；(4)生根培养：将步骤(3)的拟球茎或不定芽或丛生芽转移到生根培养基上培养40-50d，使其生根；培养条件为：5℃，暗培养；所述培养基成分如下：不定芽或拟球茎诱导培养基：MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0；胚性愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+1.0mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0；不定芽或拟球茎增殖培养基：MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0；胚性愈伤组织增殖培养基：MS基本培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0；分化培养基：MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0；生根培养基：1/2MS基本培养基+0.2mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0。