[发明专利]一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR的方法

摘要

本发明公开了一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR方法。该方法利用显微注射仪分离感染口蹄疫病毒的单个细胞，裂解后即用荧光定量RT-PCR进行定量分析。显微注射仪的可视化操作能快速准确地分离单个细胞，与高灵敏度的荧光定量RT-PCR相结合可实现检测单个细胞内病毒基因组RNA的量。该方法可用于在单细胞水平上研究病毒的复制及其与宿主细胞的关系，为病毒感染细胞生物学的深入研究提供一种新的方法。且分离与裂解细胞的技术具有广泛适用性，可直接应用于其它种类病毒感染的细胞或正常细胞的分离预处理，使得本发明的方法也能用于其它RNA病毒基因组检测和正常细胞基因组复制及转录的分子机制研究。

主权项

1、一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR方法，其步骤是：A、单细胞的分离与裂解：a、病毒感染：用50～100PFU滴度的口蹄疫病毒感染单层BHK-21细胞，18～36h后，用胰酶将细胞消化，加入6～10倍于胰酶量的新鲜MEM生长培养基灭活胰酶，分散细胞，调整细胞浓度至10⁴～10⁶个/ml，最后，取1ml细胞悬液于直径6cm的无菌培养皿中，进行单细胞分离；b、分离单细胞：分离单细胞采用：a)拉针器，b)磨针仪，c)显微注射仪，d)细胞储液，用拉针器和磨针仪制作细胞挑针，通过与显微注射仪连接的倒置显微镜直接观察待分离的细胞并能随时监控整个分离挑取单细胞的过程，用细胞挑针挑起单细胞后，直接提起伸入PCR管液面下，完成将单细胞送入PCR管内的细胞储液全过程；c、细胞裂解：每30～60min处理单细胞样品，单细胞样品于94℃～98℃热变性2～8min后，浸入液氮中，用蛋白酶K于53℃酶解40-75min，随后冻入液氮中直至进行荧光定量RT-PCR反应；B、荧光定量RT-PCR：一步法荧光定量反应液，反应总体积是50μl，2×buffer25μl，正义引物FP和反义引物RT各2μl，25μmol/L的荧光探针0.5μl，反转录和热启动TaqDNA聚合酶1μl，RNA酶抑制剂1μl，牛血清蛋白0.5μl，标准品或待测的单细胞样品5μl，无RNase的灭菌双蒸水13μl组成，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA；反应条件如下：cDNA合成：50℃    30minPCR：     95℃    5min细胞总RNA的提取，将感染口蹄疫病毒18～36h后的BHK-21细胞离心收集，加入裂解液400μl混匀，室温静置10min，加80μl氯仿，室温静置3min，于4℃12000g/min离心15min，上清液转移到另一个离心管内，加200μl异丙醇，室温沉淀10min，4℃12000g/min离心10min，弃上清，加1ml 75％乙醇充分洗涤沉淀，于4℃7500g/min离心5min，弃上清，沉淀RNA并在室温下自然干燥，加无RNase水10μl于60℃ 10min溶解，放入-70℃保存；取4～8个不同稀释度的标准品，1～2个细胞总RNA作为阳性对照，2～4个阴性对照按照前面所列出的配制反应液，进行荧光定量PCR反应。