[发明专利]番红花病毒检测方法

摘要

本发明公开了一种番红花病毒检测方法，根据CMV，TuMV，PVY，TRV病毒核苷酸序列设计了特异性引物，提取番红花组织的总RNA后，采用RT-PCR的方法，检测番红花病毒。本发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和总核酸提取法的缺点，方便、特异、灵敏的检测番红花病毒。

主权项

一种番红花病毒检测方法，其特征在于该检测方法包括下列步骤：(1)引物设计根据番红花病毒的核苷酸序列设计扩增番红花病毒外壳蛋白的特异性引物，引物序列；(2)总RNA提取：①处理：取0.2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈振荡摇匀；②RNA分离：4℃，12000rpm离心10min以除去不溶的成分，将上清液转入一新的1.5ml离心管中；③RNA提取：室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持10min后，4℃，12000rpm离心15min；④将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，室温下静置15min。4℃，12000rpm离心15min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；⑤RNA洗涤：弃去上清液，加入75％的乙醇洗涤；混匀，4℃，12000rpm离心5min；⑥弃去乙醇，沉淀于室温下自然晾干，RNA溶于40ul dH2O中，保存于-70℃备用；(3)RT-PCR扩增①反转录合成cDNA反转录以植物总RNA为模板，进行反转录合成cDNA，其反应体系为：3.0uL RNA、2.0uL 5×RT缓冲液、1.0uL dNTP/10mM、0.5uL RNA酶抑制剂40U/uL、0.5uL反转录酶XL(AMV)5U/uL、0.5uL引物和2.5uL dH2O，混合均匀后，室温放置10min，45℃水浴1h；②PCR扩增聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用步骤(1)设计的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下，聚合酶链式反应的体系为2.0uL反转录产物、2.5uL 10×Taq缓冲液、1.0uLdNTP/10mM、0.5uL Taq DNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uL dH2O；(4)电泳检测取5uLPCR产物经0.8％-1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，其反应体系为：4.5uL标物，2.0uL 10×loading buffer，7.0uL PCR产物，120V电压，电泳结束后将凝胶于10ug/uL溴化乙锭中染色15min，于凝胶成像仪中观察并记录结果。