[发明专利]利用人类皮肤黑色素细胞分析美白剂毒性和功效的方法

摘要

一种利用原代培养的人皮肤黑色素细胞对美白化学物质进行毒性和功效分析的实验方法：1.原代人皮肤黑色素细胞培养鉴定；2.利用原代人黑色素细胞对美白化学物质进行毒性分析；3.利用原代人黑色素细胞对美白化学物质的功效，即黑色素含量和酪氨酸酶活性两方面进行分析。本方法具有以下优点：体外培养的人黑色素细胞分裂增殖能力强、标准化程度高、批间差异小，具有与体内相同的产生黑色素颗粒的功能；利用健康人黑色素细胞比动物或人源的黑色素瘤细胞获得的结果更可信；从定性和定量两方面评价待测物质的毒性作用和美白功效。本发明建立的方法可以代替活体动物和人类皮肤，直接用于化学品、化妆品、药品等产品中美白物质的毒性和功效试验。

主权项

1、一种利用人类皮肤黑色素细胞分析美白剂毒性和功效的方法，分以下几个步骤：I、毒性检验(1)美白剂贮备溶液的配制PEP液的配置：将2-丙二醇、无水乙醇和无菌双蒸水按照5∶3∶2配置；PEH液的配置：将PEP液用0.01mol/L的PBS稀释10倍配置；以十二烷基磺酸钠(SDS)为毒性试验的阳性对照物；；(2)将生长至80％-90％融合的人类黑色素细胞用0.25％胰酶/0.02％EDTA消化，1200rpm/min，5min离心，得到的细胞沉淀，用黑色素细胞完全培养液制成密度为1×104cell/孔的悬液，每孔100ul，接种于96孔板，37℃，5％的CO2培养箱中培养2天；(3)用黑色素细胞完全培养液将待测美白剂稀释成不同终浓度的溶液，将96孔板中原来的培养液移走，每孔加入200ul新鲜的含有美白剂的溶液，即180ul基础培养液与20ul含待测美白剂的PEH培养液混合同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照；，37℃，5％的CO2培养箱中培养3天；(4)加入MTT溶液和二甲基亚砜(DMSO)溶液：在每孔中加入已经配置好的5mg/ml的MTT溶液20ul，在37℃孵化4小时，移走上清液，每孔中加入DMSO150ul，37℃孵化30min，充分混匀后用酶标仪在570nm处测量每孔的吸光度；(5)结果分析：细胞活力抑制率＝[1—(各浓度平均吸光度值—空白孔平均吸光度值)÷(对照组平均吸光度值—空白孔平均吸光度值)]×100％；根据抑制率曲线，计算得出待测物的致死浓度范围以及IC50半数致死浓度，即为该美白剂的毒性指标；II、功效分析该美白剂对黑色素细胞的功效实验采用两种方法：(1)黑色素细胞黑色素含量的改变1)按步骤I(3)用黑色素细胞基础培养液将待测美白剂溶解成不同终浓度的溶液，以质量浓度为20umol/L的α-MSH作为美白功效实验的阳性对照，根据试验需要可增加曲酸或熊果苷作为美白剂的参照物质，用于相对美白功效的评价；2)原代黑色素细胞的制备：制备黑色素细胞，按密度1×105cell/孔接种于6孔板；3)待测美白剂干预：将6孔板中原来的培养液移走，每孔加入1000ul含待测美白剂的培养液，其包含900ul基础培养液+100ul含待测美白剂的PEH液，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃，5％的CO2培养箱中培养6天，每隔两天换液一次；4)收集美白剂处理以后的细胞：移走培养液，用冷的PBS清洗两遍，用细胞刮刀将不同待测物处理组以及阳性、阴性对照组的细胞分别收集到不同的EP管中，10000rpm/min，4℃离心1min收集细胞；5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用1N NaOH溶液150ul溶解，并在100℃下加热10min，将获得的每种溶有各组处理后细胞的1N NaOH溶液100ul加入到96孔中；6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入99ul蛋白染料和1ul1N NaOH溶解的细胞溶液，每孔细胞设立三个测试组；7)酶标仪测量及结果分析：用酶标仪在405nm处测量步骤(5)加入96孔中各孔的吸光度，得到每孔的黑色素含量的吸光度值；用酶标仪在490nm处测量步骤(6)加入96孔板中各孔的吸光度，得到每孔的蛋白浓度吸光度值；黑素合成抑制率＝[1-(待测物孔黑色素含量的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照组黑色素含量的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％；(2)黑色素细胞酪氨酸酶活性的改变1)同步骤II(1)1)-4)；5)裂解细胞，释放黑色素颗粒：收集后的细胞用0.1M磷酸盐缓冲液，含有质量百分比1％的Triton-X-100和100ug/ml的苯甲基磺酰氟的细胞裂解液150ul溶解，用声裂法充分裂解，操作均在冰上进行，充分裂解后，13000rpm/min，4℃离心20min；得到的上清液即含酪氨酸酶的胞质蛋白；6)每孔细胞蛋白浓度的分析：在96孔板中每孔加入98ul蛋白染液和2ul细胞裂解液溶解的胞质蛋白，每孔细胞设立三个测试组；用酶标仪在490nm处测量各孔的蛋白浓度的吸光度值；7)酪氨酸酶活性试验：在96孔板中每孔加入90ul各孔含胞质蛋白的细胞裂解液，10ul 2mg/ml的L-DOPA溶液，对照组为90ul不含蛋白的细胞裂解液和10ul2mg/ml的L-DOPA溶液，因为无色的L-DOPA在胞质蛋白中所含的酪氨酸酶的作用下会变成黑色的多巴醌，而在无酪氨酸酶的作用下，无色的L-DOPA也会在空气中的氧化作用下慢慢变黑；所以在37℃下反应1小时，每十分钟用酶标仪在475nm处测量一次各孔的吸光度，即通过黑色多巴醌的吸光度来反应酪氨酸酶的活性；8)结果分析：酪氨酸酶活性抑制率＝[1-(各待测物浓度孔的吸光度值÷待测物孔蛋白浓度的吸光度值)÷(阴性对照孔的吸光度值÷阴性对照组蛋白浓度的吸光度值)]×100％。