[发明专利]结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种包含了结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体及其应用。该表达载体的构建方法是：(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65基因的编码序列设计抗原基因Hsp65的1对引物P1和P2；(2)以质粒pEGFPHsp65为模板，用引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65；(3)pCR-G载体的构建；(4)pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建；(5)中间载体pCRGHsp65的克隆与构建；(6)目的载体pCAMBIA1300GHsp65的克隆与构建。本发明结核Hsp65抗原基因的表达载体可用于制备疫苗。

主权项

1、一种包含了结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65基因的编码序列设计抗原基因Hsp65的1对引物：上游引物序列为：P1 5′-TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTGCGT-3′，含BglII酶切位点和起始密码子ATG；下游引物序列为：P2 5′-CC TCTAGA TCAGAAATCCATGCCACCCATG-3′，含Xba I酶切位点和终止密码子CTA；(2)以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65；将扩增产物Hsp65直接插入pMD20-T载体，获得目的基因pMD20-THSP65；(3)pCR-G载体的构建：用HindIII和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和经琼脂糖电泳分离，从pUBCG酶切产物回收1.4kb的玉米种子特异表达启动子glubulin-1，从酶切产物回收3.9kb的载体片段，将两个回收片段连接、转化获得重组质粒pCR-G；(4)pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建：用SacI和EcoRI分别双酶切质粒pGFP-2和pUC18，经琼脂糖电泳分离，从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos片段，从pUC18酶切产物中回收2.6kb的载体片段，将两个回收片段连接、转化获得重组质粒pUC18-nos；用XbaI和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位点的DNA片段，与经相同处理的质粒pCAMBIA-1300连接、转化获得重组质粒pCAMBIA-1300-nos；用XhoI酶切质粒pMDX1，回收560bp的bar基因片段，用XhoI切除质粒pCAMBIA-1300-nos内潮霉素抗性基因，回收pCAMBIA-1300-nos并进行末端脱磷酸；将bar基因片段与pCAMBIA-1300-nos连接、转化获得重组质粒pCAMBIA1300-nos-bar；(5)中间载体pCRG Hsp65的克隆与构建：用BamHI和XbaI分别双酶切步骤(3)所得质粒pCR-G和步骤(2)所得pMD20-THSP65，经琼脂糖电泳分离，纯化后进行连接、转化筛选获得重组载体pCRG Hsp65；(6)目的载体pCAMBIA1300GHsp65的克隆与构建：用HindIII和XbaI双酶切步骤(5)所得重组载体pCRGHsp65，得到globulin-1和Hsp65的联合片段，将HindIII和XbaI双酶切步骤(4)所得pCAMBIA1300--bar后的片段与上述联合片段连接、转化筛选获得目的载体pCAMBIA1300GHsp65。